Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.
CA2 +-signalering is essentieel voor normale spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid. Ook is de Acrosoom reactie essentieel voor het vermogen van een menselijke spermacel bevruchten van de eicel te doordringen van de zona zitten. Het is daarom van groot belang voor het testen van de verbindingen (bijvoorbeeld milieu chemicaliën of drugkandidaten) voor hun effect op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma te onderzoeken van de potentiële schadelijke effecten op de menselijke spermacel functie of om te onderzoeken een mogelijke rol als een voorbehoedsmiddel. Hier twee medium-throughput assays worden beschreven: 1) een fluorescentie gebaseerde assay voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering in menselijk sperma, en 2) een kwantitatieve analyse van beeld, cytometrische voor beoordeling van Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Deze tests kunnen worden gebruikt om een groot aantal compounds voor effecten op Ca2 +scherm-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Bovendien, de testen te genereren zeer specifieke dosis / respons-curven van afzonderlijke verbindingen, potentiële additiviteit/synergie voor twee of meer verbindingen bepalen, en te bestuderen van het farmacologische werkingsmechanisme via competitieve remming kunnen worden gebruikt experimenten met CatSper-remmers.
Het doel van de twee tests die hier beschreven is het onderzoeken van de effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma, zoals is aangetoond voor meerdere verbindingen in diverse publicaties met deze testen1,2, 3,4,,5,,6,7. CA2 +-signalering en de Acrosoom reactie zijn beide essentieel voor normale menselijke spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid.
Het algemene doel van een menselijke zaadcel is om te bevruchten het ei. Om te kunnen met succes en natuurlijk bevruchten het ei, moeten de functies van de spermacel strak worden geregeld tijdens de reis van de spermacel tot en met het vrouwelijke voortplantingssysteem8,9. Veel van de functies van de spermacel worden geregeld via de intracellulaire Ca2 +-concentratie [Ca2 +]ik (bijvoorbeeld een sperma motiliteit, chemotaxis en Acrosoom reactie)10. Ook is een rijpingsproces genaamd rechtsbevoegdheid, waardoor de spermacel kan de eicel bevruchten, deels gereguleerd door [Ca2 +]ik10. CA2 +-diepte Ca2 +-ATPase pompen11 handhaven een ongeveer 20.000 vouw Ca2 +-gradiënt over het menselijk sperma celmembraan, met een rust [Ca2 +]ik van 50-100 nM. Als Ca2 + is toegestaan te steken van de celmembraan (bijvoorbeeld door de opening van Ca2 +-kanalen), een flinke toestroom van Ca2 + optreedt, die aanleiding geven tot een hoogte van [Ca2 +]ik. De spermacel draagt echter ook intracellulaire Ca2 +-winkels, die Ca2 vrijkomen kunnen + en, derhalve, ook geven een hoogte van [Ca2 +]i12stijgen. Interessant is dat alle kanaal-gemedieerde Ca2 +-instroom in menselijke zaadcellen tot nu toe is gebleken dat optreden via CatSper (katIonische kanaal van Sperm), die alleen wordt uitgedrukt in zaadcellen11. In menselijke zaadcellen, CatSper wordt geactiveerd door de endogene liganden progesteron en prostaglandines via verschillende ligand bindend sites13,14,15, leiden tot een snelle Ca2 +-instroom in de spermacel. Twee hoofdbronnen in de buurt van het ei bevatten hoge niveaus van deze endogene liganden. Een is de folliculaire vloeistof die hoge niveaus van progesteron16 bevat. De folliculaire vloeistof wordt vrijgelaten uit de rijpe follikels samen met de eicel bij ovulatie en mixen met de vloeistof binnen de oviducts17. De andere belangrijkste bron is de cumulus cellen die omringen het ei en vrijgeven van hoge niveaus van progesteron en prostaglandines. De progesteron geïnduceerde Ca2 +-instroom in de zaadcellen heeft aangetoond dat bemiddelen chemotaxis naar de ei9,18,19,20 van de beweeglijkheid van de zaadcellen bepalen en stimuleren het Acrosoom reactie21. Triggering van deze individuele [Ca2 +]ik-gereglementeerde sperma functies in de juiste volgorde en op het juiste moment is van cruciaal belang voor de bevruchting van de eicel8. In overeenstemming met deze, een suboptimaal progesteron geïnduceerde Ca2 +-instroom is gebleken dat geassocieerd met verminderde mannelijke vruchtbaarheid22,23,24,25,26 ,27,28,29 en functionele CatSper is essentieel voor de mannelijke vruchtbaarheid26,30,31,32, 33,34,35,,36.
Als de zaadcellen de eicel te bereiken, een opeenvolging van gebeurtenissen moet plaatsvinden voor bevruchting optreden: 1) de zaadcellen moeten doordringen in de omringende cellaag van cumulus, 2) binden aan de zona zitten, 3) de acrosomal inhoud, de zogenaamde Acrosoom reactie exocytose 37, 4) dringen de zona zitten, en 5) zekering met het membraan van de eicel te voltooien bevruchting38. Om te kunnen deze stappen doorlopen en bevruchten het ei, moet de spermacel eerst rechtsbevoegdheid11, die begint als de zaadcellen verlaten de zaadvocht vloeistof met “decapacitating” factoren39 en in het vocht van de vrouw zwemmen ondergaan voortplantingssysteem met hoge niveaus van bicarbonaat en albumine37. Rechtsbevoegdheid maakt kundig voor hyperactivering, een vorm van beweeglijkheid met een krachtige gewonnen van het flagellum en Acrosoom reactie37ondergaan de zaadcellen. De beweeglijkheid van de Hyperactivated is vereist voor de penetratie van de zona zitten40, en de Acrosoom bevat verschillende hydrolytische enzymen die deze penetratie proces41 helpen. Bovendien maakt de Acrosoom reactie de zaadcellen kunnen versmelten met het ei door specifieke membraaneiwitten op het sperma oppervlak nodig voor sperma-ei fusion42bloot te leggen. Bijgevolg, het vermogen om te hyperactivering en Acrosoom reactie ondergaan zijn beide nodig zijn voor een succesvolle bevruchting van de eicel40,42. In tegenstelling tot wat is gezien voor muis zaadcellen43,44,45, kunt alleen menselijk sperma cellen die Acrosoom-intacte binden aan de zona zitten46. Wanneer de menselijke zaadcellen zijn gebonden aan de zona zitten die zij moeten ondergaan de Acrosoom reactie te doordringen van de zona zitten41 zowel specifieke membraaneiwitten die nodig zijn voor de fusie met de ei-38bloot te stellen. De timing van de Acrosoom reactie in het menselijk sperma is dus essentieel voor bevruchting optreden.
Zoals hierboven beschreven, Ca2 +-signalering is van vitaal belang voor sperma van normale cel functie8, en het is daarom van groot belang voor zitten kundig voor scherm groot aantal compounds voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijke zaadcellen. Op dezelfde manier zoals alleen menselijke zaadcellen die ondergaan Acrosoom reactie op de juiste tijd en plaats kan doordringen van de zona zitten en het ei46,47 bevruchten, is het ook van groot belang om het testen van de verbindingen om hun vermogen om te kunnen invloed op de reactie van de Acrosoom in menselijk sperma. Te dien einde twee medium-throughput screening tests worden beschreven: 1) een bepaling voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijke zaadcellen, en 2) een bepaling voor de capaciteit voor het opwekken van Acrosoom reactie in menselijke zaadcellen.
Assay 1 is een medium-doorvoer Ca2 +-signalering assay. Deze fluorescentie plaat lezer gebaseerde techniek registreert wijzigingen in fluorescentie als functie van de tijd gelijktijdig in meerdere wells. De Ca2 +-gevoelige fluorescente kleurstof, Fluo-4 heeft een Kd voor Ca2 +≈ 335 nM en is cel-permeant in de vorm van de ester AM (acetoxymethyl). Met behulp van Fluo-4, is het mogelijk voor het meten van veranderingen in [Ca2 +]i na verloop van tijd en na toevoeging van verbindingen van belang zijn voor de zaadcellen. De test werd ontwikkeld door het laboratorium van Timo Strünker in 201113 en wordt sindsdien gebruikt in verschillende studies naar scherm verbindingen voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijk sperma1,2,3, 4,5. Ook is een gelijkaardige methode gebruikt om het scherm van meerdere drugs kandidaten48. Bovendien, is deze test ook nuttig voor de beoordeling van de farmacologische modus van actie1,2,3,4,5, dosis / respons-curven1, 2,3,4,5, competitieve remming1,2, additiviteit1,2en synergie3 van verbindingen van belang.
Assay 2 is een medium-doorvoer Acrosoom reactie test. Deze afbeelding cytometer gebaseerde techniek meet de hoeveelheid levensvatbare Acrosoom reageerde zaadcellen in een monster met behulp van drie fluorescente kleurstoffen: propidium jodide (PI), FITC-coupled lectine van Pisum sativum (FITC-PSA) en Hoechst-33342. De bepaling van een gelijkaardige stroom cytometry gebaseerde methode is bewerkt door Zoppino et al.49 en is gebruikt in diverse studies6,7. Wat betreft de Ca2 +-signalering assay, deze Acrosoom reactie test kan ook worden gebruikt om te beoordelen van de dosis / respons-curven, remming, additiviteit en synergie van stoffen van belang.
De middellange doorvoer Ca2 + signalering assay is gebaseerd op metingen van de fluorescentie van elk één microwells dat bevat ongeveer 250.000 zaadcellen. Het vastgelegde signaal is gemiddeld van alle individuele zaadcellen in de put. De bepaling vormt dus dat geen ruimtelijke informatie over waar u specifiek in de spermacel [Ca2 +]ik wordt gewijzigd, in hoe groot een deel van de zaadcellen een verandering in [Ca2 +]i vindt plaats, of hoe heterogene het antwoord i…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen het lab van Timo Strünker voor toezicht op de AR en DLE tijdens hun verblijf bij zijn lab. Voorts bedank we onze collega’s van het departement van groei en voortplanting, Copenhagen University Hospital, Rigshospitalet voor hun hulp bij het opzetten van deze twee testen. Dit werk werd gesteund door subsidies van het innovatiefonds Denemarken (subsidie cijfers 005-2010-3 en 14-2013-4).
0.2 µm pore filter | Thermo Fisher Scientific, USA | 296-4545 | |
1 L measuring cylinder | Thermo Fisher Scientific, USA | 3662-1000 | |
1,4 and 2 mL plastic tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 and 0030120094 | |
12-channel pipette | Eppendorf, Germany | 4861000813 | |
384 multi-well plates | Greiner Bio-One, Germany | 781096 | |
15 and 50 mL platic tubes | Eppendorf, Germany | 0030122151 and 30122178 | |
A2-slide | ChemoMetec, Denmark | 942-0001 | |
Automatic repeater pipette | Eppendorf, Germany | 4987000010 | |
CaCl2 | |||
Centrifuge | |||
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample | |||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) | Sigma-Aldrich, Germany | L0770 | |
Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific, USA | F14201 | |
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader | BMG Labtech, Germany | ||
Glucose anhydrous | |||
HEPES | |||
Hoechst-33342 | ChemoMetec, Denmark | 910-3015 | |
Human serum albumin (HSA) | Irvine Scientific | 9988 | For addition to HTF+ |
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water | |||
Incubator | |||
KCl | |||
KH2PO4 | |||
Magnetic stirrer | |||
MgSO4 | |||
Na-Lactate | |||
NaCl | |||
NaHCO3 | |||
NC-3000 image cytometer | ChemoMetec, Denmark | 970-3003 | |
Pipettes and piptting tips | |||
propidium iodide (PI) | ChemoMetec, Denmark | 910-3002 | |
Purified water | |||
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle | |||
S100 buffer | ChemoMetec, Denmark | 910-0101 | |
SP1-cassette | ChemoMetec, Denmark | 941-0006 | |
Volumetric flasks of appropriate sizes | |||
Vortexer |