Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.
Intranasale (IN) drug delivery aan de hersenen is ontstaan als een veelbelovende methode om te omzeilen de bloed-hersen barrière (BBB) voor de levering van geneesmiddelen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Recente studies tonen het gebruik van een peptide, RVG9R, met inbegrip van de minimale receptor-bindende domein van de rabiësvirus glycoproteïne, in het opwekken van de levering van siRNA in neuronen in de hersenen. In dit protocol wordt de peptide-siRNA-formulering intra-tranasaal met een pipet in de dominante hand geleverd, terwijl de verdoemde muis wordt vastgehouden door de Scruff met de niet-dominante hand in een “hoofd-en-voorwaartse positie” om drainage in de longen te voorkomen en maag bij inademing. Deze precieze aangrijping van muizen kan worden geleerd, maar is niet gemakkelijk en vereist praktijk en vaardigheid om te resulteren in effectieve CNS opname. Bovendien is het proces lang getekend, waarbij ongeveer 45 min nodig is voor de toediening van een totaal volume van ~ 20-30 μL oplossing in de druppel volumes van 1-2 μL per inhalatie, met 3-4 min rustperioden tussen elke inhalatie. Het doel van deze studie is om een muis positionerings apparaat te onthullen dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor een efficiënte toediening van de peptide-siRNA-formulering. Meerdere functies zijn opgenomen in het ontwerp van het apparaat, zoals vier of acht positionerings stoelen met instelbare hoogte en Tilt om verdoofd muizen in de Head Down-and-forward positie te rebelasten, waardoor een eenvoudige visualisatie van de Nares van de muizen en een ingebouwde verwarmingspad om de lichaams temperaturen van de muizen tijdens de procedure te behouden. Belangrijk is dat de mogelijkheid om vier of acht muizen tegelijkertijd met RVG9R-siRNA-complexen te behandelen op deze manier studies mogelijk maakt op een veel snellere tijdschaal, voor het testen van een IN therapeutische siRNA-aanpak. Tot slot, dit apparaat zorgt voor passende en gecontroleerde muis hoofd positionering voor IN de toepassing van RVG9R-siRNA en andere therapeutische moleculen, zoals nanodeeltjes of antilichamen, voor de levering van CNS.
De BBB voorkomt dat systemisch toegediende moleculen van > 400-600 da de hersenen binnendringen, wat een belangrijke uitdaging is voor de afgifte van therapeutische biomoleules voor ziekten die het CZS en Brain1beïnvloeden. Directe geneesmiddelafgifte aan de hersenen kan worden bereikt door stereotactische injectie; echter, dit vereist chirurgische expertise en is sterk beperkt in de levering aan gebieden proximale op de injectieplaats, waardoor het ongeschikt voor routine klinisch gebruik2. IN de levering aan de hersenen kan ook resulteren in directe levering van de hersenen door het omzeilen van de BBB, waardoor voor de directe en snelle overdracht van een verscheidenheid van stoffen naar de hersenen3,4. Deze overdracht wordt verondersteld te gebeuren door transport mechanismen via de olfactorische en trigeminus zenuwen die de nasale passage verbinden met de hersenen, de cerebrospinale vloeistof, en de lymfatische systemen5. Omdat de directe neus-naar-hersen route geen perifere organen en weefsels omvat, vermindert het de systemische bijwerkingen aanzienlijk en verbetert het de potentie. IN de administratie is een veelbelovende niet-invasieve alternatief voor zowel lokale en systemische routes voor de levering van de hersenen van therapeutische middelen en kan een krachtige aanpak voor de bestrijding van neurologische aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en hersenkanker, en wordt onderzocht in verschillende klinische proeven6,7,8.
Verschillende experimentele factoren, zoals volume en methode van inoculatie, evenals formulering pH, sterk invloed op de levering van geneesmiddelen aan het CZS via de neus-naar-hersenen traject9. In studies met muizen, het succes van IN de levering van geneesmiddelen sterk afhangt van de juiste hoofd positionering, die essentieel is voor efficiënte hersen afzetting en om te voorkomen dat de afvoer van de drug in de externe omgeving of de luchtwegen. Met name, de meerderheid van de knaagdieren studies gebruik maken van een Head-Back positie (supine) met een 70 °-90 ° Tilt voor de levering van geneesmiddelen aan de olfactorische epitheel, hoewel hoofd positionering op 0 ° kan gunst drainage in de luchtpijp9. BIJ de levering van geneesmiddelen in muizen die wakker zijn resulteert in verminderde hersen depositie in vergelijking met elke toepassing in de liggende positie, vooral als gevolg van wetenschappers onvermogen om muizen te houden in de gewenste positie voor langere tijd. Bovendien, de ondersteboven positie vereist door de skin grip methode gebruikt voor wakker muizen resulteert in drug afzetting voornamelijk in de trigeminuszenuw en de olfactorische gloeilamp, evenals perifere organen, zoals nieren en longen, binnen 30 min postinoculatie10. De meest geschikte lichaamspositie voor de levering van therapeutische middelen via de olfactorische of trigeminus zenuwen bij grotere dieren zoals niet-humane primaten in klinische studies lijkt de kop-en-voorwaartse positie te zijn (d.w.z. de zogenaamde “bidden tot Mekka positie “)11. Echter, deze positie is niet goed bestudeerd in het muismodel, en de rugpositie wordt meer gebruikt in knaagdieren studies.
Eerder, we hebben aangetoond dat de RVG9R, een peptide ontworpen op basis van de minimale receptor bindende domein van de rabiësvirus, toont tropisme aan cellen uitdrukken van nicotine acetylcholine receptor subeenheden zoals neuronen en macrofagen en bemiddelt de intracellulaire afgifte van siRNA door een mechanisme waarbij receptor betrokkenheid en tijdelijke plasma membraan delocalisatie op de site van receptor aggregatie12,13. Belangrijk is dat de systemische intraveneuze toediening van RVG9R-siRNA-complexen de transvasculaire afgifte van siRNA in het CZS14mogelijk maakt. De systemische route verdunt echter de hoeveelheid siRNA die aan het CZS wordt afgeleverd, en uit recente gegevens blijkt dat de toediening van RVG9R: siRNA-complexen aan muizen die zich in de kop-en-voorwaartse positie bevinden, een breed gespreide doel-gen knockdown uitlokken in meerdere regio’s van de hersenen15. Belangrijk is dat dit niveau van knockdown werd bereikt met slechts 13,5 μg siRNA toegediend over een vierdosis, 2 dagen regime, terwijl de I.V.-route een ~ 5 maal hogere dosis per injectie vereist om een vergelijkbare knockdown te bereiken. De enige tekortkoming van de aanpak is dat het een moeizame procedure is, waarbij het gebruik van beide handen tijdens de toediening van de oplossing vereist is, terwijl de muizen continu worden vastgegript in het hoofd naar beneden en naar voren en in ontspannen posities tussen elke inhalatie voor een aanzienlijke lange behandelingsperiode (een 30-45 min procedure voor de effectieve opname van een ~ 20-30 μL volume per muis). Het gebruik van de hier gepresenteerde muis positionerings inrichting maakt de juiste plaatsing van muizen met weinig fysieke dwang mogelijk voor de dieren en het personeel dat het protocol uitvoert, evenals voor de behandeling van meerdere cohorten van muizen binnen een redelijke periode, het inschakelen van een diepgaand onderzoek naar het gebruik van Sirna’s als therapeutische behandeling voor encefalitis in de westelijke Nijl bij muizen in de late stadia van de ziekte15.
We hebben een muis positionerings apparaat ontwikkeld voor het optimaal positioneren van muizen voor de neus-tot-hersen afgifte van Therapeutics. Het apparaat is uitgerust met verschillende functionaliteiten, wat zorgt voor een eenvoudige gelijktijdige omgang met dieren. Het is ook uitgerust met verwarmings pads voor het onderhoud van de fysiologische lichaamstemperatuur van de dieren tijdens experimenten. De verdoofd muizen kunnen worden gehandhaafd in de kop-en-voorwaartse positie door middel van speciaal ontworpen stoelen, met een minimaal ongemak voor de dieren. De hoogte van de positionerings stoelen kan op zodanige wijze worden afgesteld dat het het beste is om dierlijke neusgaten te visualiseren tijdens het toedienen van drugs.
IN de hersenen levering heeft verschillende intrinsieke beperkingen, met inbegrip van het kleine oppervlak van neusgaten (waardoor maximaal volume van 20-30 μL per toediening), nasale irritatie, epitheel schade, en beperkte absorptie over het neus epitheel18. De toediening van geneesmiddelen aan muizen die in rugligging worden geplaatst, is gebruikt voor de levering van de hersenen door vloeibare geneesmiddelen in de alternatieve Nares van de dieren te laten vallen via een pipet of polyurethaan slang (24 G x 19 mm) verbonden met microliter spuiten19, 20. Hoewel het gebruik van slangen systemen om geneesmiddelen in de buurt van het olfactorische epitheel vrij te geven een potentieel geschikte aanpak is, veroorzaakt het irritatie of nasale ontstekingen bij herhaalde toediening. Bovendien beperkt de kleine grootte van de neusholte deze aanpak, vooral in muizen die kunnen worden overwonnen door te herhalen, evenals door medicijn formuleringen die aanhouden in het neusslijmvlies. Een andere optie is de IN toediening van Therapeutics om muizen10wakker te maken. Deze aanpak vereist echter bekwame procedures voor de behandeling van dieren tijdens de inoculatie. Bovendien, het veroorzaakt dierlijke stress en daarom is niet ideaal voor ziekte modellen, met name besmettelijke ziekte modellen. Bovendien kan een inconsistente dosering gemakkelijk voortvloeien uit de drainage van het geneesmiddel in de longen of de maag als gevolg van onvolmaakte dieren aangrijpend. De hier gepresenteerde aanpak stelt wetenschappers in staat om deze technische barrières te overwinnen. De Head Down-and-forward positie vermindert de mogelijkheid van drugs lekkage uit de neus naar de longen tijdens het inademen, begunstiging van directe en selectieve siRNA levering aan de hersenen. BIJ aflevering met behulp van de muis positionerings apparaat vereist geen gespecialiseerde techniek voor het hanteren of aangrijpend van de dieren tijdens de inoculatie. Vier dieren tegelijk kunnen worden behandeld voor een periode van ten minste 30-45 min. De procedure kan worden opgeschaald door het opnemen van een extra vier-Chair Bar, waardoor het eenvoudig beheer van maximaal acht muizen in dezelfde experimentele sessie. Daarom, naar aanleiding van deze methode, een enkele exploitant kan het medicijn leveren aan de hersenen van grote groepen dieren gedurende langere tijd induceren.
De anatomische structuur van de neusholte beïnvloedt de neus-naar-hersen levering sterk (zoals beoordeeld door Merkus et al.11 en Ruigrok en de lange21). Het relatieve oppervlak van de neusholte bij muizen is 15 keer groter dan die van de mens en het relatieve oppervlak van het olfactorische epitheel is 6 keer groter. Hoewel er aanzienlijke verschillen zijn in de anatomie van de neusholte bij mensen aan knaagdieren, zijn er ongeveer 45 klinische proeven aan de gang met behulp van de IN-aanpak voor de behandeling van verschillende hersenaandoeningen (www.clinicaltrials.gov). De hier gepresenteerde studie geeft aan dat bij het gebruik bij de levering van Therapeutics, wetenschappers moeten overwegen verschillende factoren, zoals hoofdpositie, slapen, en juiste levering agenten.
We hebben aangetoond dat de efficiënte en specifieke afzetting van fluorescently gelabeld siRNA aan de muis hersenen. Bovendien is de significante afname in SOD1 genexpressie die na IN siRNA Delivery werd waargenomen, bevestigde functionele effecten. We eerder toonde consequent dat de IN het beheer van RVG9R-siRNA complexen gericht op de West Nile Virus (WNV) RNA oefent een sterk therapeutisch effect op WNV encefalitis15. Met name, neus-naar-hersenen siRNA levering vereist een cel-targeting ligand (RVG) en een positief geladen molecuul (9R) aan complexe siRNA. Bij afwezigheid van deze elementen werden moleculen gecleard via het systemische circuit en lymfevaten 48 h nabehandeling (Figuur 3a)15. Daarom hebben we in de hier beschreven experimentele instelling peptide/siRNA-lokalisatie 48 h na inoculatie onderzocht om alleen de niveaus te behouden die specifiek in de hersenen worden bewaard. Deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgevoerd voor de levering van andere moleculen, zoals eiwitten, peptiden en nanodeeltjes, of andere therapieën, voor de behandeling van een aantal hersen gerelateerde aandoeningen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door het Koreaanse Ministerie van volksgezondheid & welzijn (HI17C1046) tot S.K.L.
Comercial assays | |||
iScript cDNA synthesis kit | BioRad | Cat# 1708891 | |
RNAiso plus | TaKaRa Bio | Cat# 9108 | |
SYBR Premix ExTaq | TaKaRa Bio | Cat# RR420A | |
Dyes | |||
Alexa fluor 488 | ThermoFisher | Cat# A30052 | |
Mouse strain | |||
Balb/c | Orient Bio | N/A | 6-8 week old, 20-30g |
Oligonucleotides and primers | |||
Human CD4 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’ |
siSOD1 | ST Pharm | N/A | Sense: 5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’ |
GAPDH primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’ |
SOD1 primers | ST Pharm | N/A | F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’ |
Peptides | |||
RVG9R | Peptron | N/A | YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR |
RVM9R | Peptron | N/A | MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR |
Software, algorithms and devices | |||
FlowJo software 4.3 | FlowJO, LLC | N/A | http://docs.flowjo.com/vx/ |
Mouse positioning device | Signet Biotech | N/A | |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |
Prism software | Graphpad | N/A | https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/ |