Summary

Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

Published: March 07, 2019
doi:

Summary

Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.

Abstract

O burst oxidativo ou respiratório é usado para descrever o rápido consumo de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos fagócitos em resposta a vários estímulos imunes. ROS, gerados durante a ativação imune exerce potente atividade antimicrobiana, principalmente através da capacidade de ROS de danificar o DNA e proteínas, causando a morte de microorganismos. Ser capaz de medir a produção de ROS reproducibly e com facilidade é necessário a fim de avaliar a contribuição de vários caminhos e moléculas deste mecanismo de defesa do hospedeiro. Neste artigo, demonstramos a utilização de sondas fluorescentes e fluxo cytometry para detectar a produção de ROS. Apesar de amplamente utilizado, medição fluorescente de ROS é notoriamente problemática, especialmente com relação à medição de ROS induzida por estímulos específicos e não mitogênico. Apresentamos uma metodologia detalhada para detectar ROS gerada como resultado específico FcγR estimulação, começando com a geração de macrófagos, escorva, coloração, FcγR cross-linking e terminando com a análise de fluxo cytometric.

Introduction

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em 1). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactivas de oxigénio promovem os danos de proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou morte e Estados de doença patológica. No entanto, atualmente é apreciado que ROS também pode atuar como moléculas sinalizadoras (sinalização redox), e mediada por ROS modificação de várias moléculas e via intermediários pode influenciar o metabolismo celular, proliferação, sobrevivência, inflamatória sinalização e envelhecimento2. Em células fagocíticas, ROS desempenha um papel essencial no fornecimento de atividade antimicrobiana durante a chamada “explosão respiratória”1,3,4,5,6. Durante a resposta dos fagócitos a estímulos externos, componentes da oxidase NADPH complexo (p40phox, p47phox, p67phox) translocar do citosol para a membrana phagosomal, que contém a gp91phox e p22phox subunidades, e juntamente com as ações do Rac1/2, formam um totalmente funcional NADPH oxidase complexo enzimático. A oxidase de NADPH montado então utiliza NADPH para reduzir o oxigênio ao superóxido dentro do vacúolo phagosomal. Ânions superóxido diretamente podem causar danos ou ser dismutated em peróxido de hidrogênio. Tanto o superóxido e o peróxido de hidrogênio podem reagir com outras moléculas para gerar radicais hidroxila altamente reativos. Dano é mediado por reação destas ROS com proteínas ferro-enxofre ou causando oxidação base de DNA, conduzindo finalmente ao metabolismo microbiano restrito ou morte do micróbio5. A importância da enzima oxidase NADPH complexa e ROS produzidos durante a explosão respiratória é ilustrado clinicamente em pacientes com doença granulomatosa crônica (CGD)7,8,9, 10. indivíduos com CGD possuem mutações em gp91phox, resultando em uma falta de produção de ROS e susceptibilidade a infecções com bactérias e fungos que normalmente não são uma preocupação com os indivíduos imunocompetentes. Portanto, se estudar oxidativo estresse, sinalização redox ou defesa do hospedeiro, sendo capaz de medir a produção de ROS em tempo real é um esforço útil.

Vários ensaios têm sido utilizados para a produção de ROS de medida ou os resultados do stress oxidativo11,12,13. Entre estes, um do mais amplamente utilizado é a sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo2-DA)14. Esta molécula é lipofílico e incolor. Difusão de Diniz Melo2-DA através da membrana celular permite a ser postas em prática por esterases intracelulares, que deacetylates-lo em Diniz Melo2, tornando-se células impermeáveis. As ações de vários tipos de ROS (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico e radicais de peróxido) na Diniz Melo2 -oxidam em DCF, que é fluorescente (relatado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e pode ser detectada usando um fluxo citômetro equipado com um filtro padrão definido para fluoresceína (FL1 canal). Superóxido pode reagir com outra sonda dihydroethidium (DHE) para produzir o produto fluorescente 2-hydroxyethidium (bem como outros produtos de oxidação de superóxido independente fluorescente)15, mas não reage fortemente com Diniz Melo2 . Produtos de oxidação DHE fluorescentes podem ser detectados usando um comprimento de onda de excitação de 518 nm e um comprimento de onda de emissão de 605 nm (canal FL2). Embora relativamente simples de usar, a utilização de tais sondas para a deteção de ROS requer conhecimento de suas limitações e cuidadosa incorporação de coloração procedimentos e controles para o ensaio específico, sendo realizado a fim de ter válido experimental resultados e conclusões. O protocolo a seguir demonstra o uso de um kit disponível comercialmente, empregando estes 2 sondas projetadas para medir ROS por citometria de fluxo. Podemos manchar aprontados macrófagos derivados da medula óssea com estas sondas e induzir a produção de ROS através do cross-linking FcγR. Apresentamos dados representativos obtidos usando este protocolo e sublinhar as devidas precauções que devem ser empreendidas para experimentação bem sucedida.

Protocol

O protocolo para manuseio de animal foi aprovado pelo Comitê institucional Cuidado Animal e uso de (IACUC) da Universidade da Flórida Central. 1. geração de medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) Preparação de meios de cultura Preparar a mídia de base D10F: A de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic …

Representative Results

Usando o protocolo descrito dentro, apresentamos dados representativos, demonstrando a deteção de cytometric do fluxo de produção de ROS, resultante da estimulação da WT C57BL/6J BMDMs através da FcγR. Como esperado, observamos alterações mínimas na fluorescência FL1 ou FL2 acima dos níveis de fundo nas células unstimulated (Figura 3A, comparar “manchadas, unstimulated” vs “imaculado, unstimulated” ponto parcelas). Observamos um aumento na fluorescência FL1 e FL2, quando as c?…

Discussion

2-[NULL] de Diniz Melo e detecção baseada em DHE de ROS é uma técnica amplamente utilizada14,15. Facilidade de uso e a adaptabilidade destas sondas ROS para formatos de microplacas cinética, análise de fluorescência microscopia ou fluxo cytometric contribuiu para sua popularidade. No entanto, em nossos estudos de funções de macrófagos mediada por FcγR, lá não parecem ser um protocolo padrão para a realização deste ensaio para análise d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer a outros membros do laboratório Tigno-Aranjuez incluindo Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh por sua ajuda na manutenção de colônia de manutenção e rato de laboratório. Suporte para esta pesquisa foi fornecido por grant R00 HL122365 e fundos de start-up para J.T.T-A.

Materials

Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

Play Video

Cite This Article
Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

View Video