Summary

התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

Published: June 20, 2019
doi:

Summary

התבוננות בחלוקת המים בתוך העצה מספקת מידע משמעותי בנוגע לדינמיקה של זרימת מים בצמחי הודי. במחקר זה, אנו מדגימים את הגישה המעשית להתבונן הפצת מים עצה באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM, אשר מבטלת שינויים מעשיים במצב המים במהלך הכנת המדגם.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מותקן מותקנת-יחידת (ההקפאה-SEM) מאפשר תצפית דגימה בטמפרטורות מתחת ושימש לחקר הפצת מים ברקמות הצמח בשילוב עם הקפאת טכניקות קיבוע באמצעות חנקן נוזלי ( ב 2). עבור מינים וודי, עם זאת, ההכנות להתבוננות במשטח החתך הרוחבי של עצה כרוכות בקשיים כתוצאה מכיוון של סיבי עץ. בנוסף, מתח גבוה יותר בעמודת המים ב-עצה יכול מדי פעם לגרום לשינויים העובדתיים בהפצת המים, במיוחד במהלך קיבוע המדגם והגבייה. במחקר זה, אנו להפגין הליך יעיל להתבונן התפלגות המים בתוך עצה של צמחים וודי באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM. בתחילה, במהלך איסוף המדגם, מדידת פוטנציאל המים עצה צריך לקבוע אם המתח הגבוה נמצא בתעלות עצה. כאשר הפוטנציאל הגלום במים נמוך (< ca. 0.5 MPa), נדרש הליך הרפיה במתח כדי לאפשר שימור טוב יותר של מעמד המים ב-עצה במהלך דגימת קיבוע ההקפאה. בשלב הבא, צווארון המים האטומה מוצמד מסביב לגבעול העץ ומתמלא ב-LN2 לצורך הקפאת הקיבעון של מעמד המיים של xylem. לאחר הקציר, יש לנקוט כדי להבטיח כי המדגם נשמר קפוא תוך השלמת ההליכים של הכנה לדוגמה להתבוננות. קריוסטט מועסק בבירור לחשוף את המשטח הרוחבי עצה. בתצפיות ההקפאה, התאמת הזמן לחריטה בהקפאה נדרשת כדי להסיר אבק כפור ולהדגיש את קצה קירות התא על משטח הצפייה. התוצאות שלנו להפגין את תחולת טכניקות ההקפאה-SEM להתבוננות של הפצת מים בתוך עצה ברמות סלולר ו subcellular. השילוב של ההקפאה-SEM עם שאינם הרסניים טכניקות תצפית באתרו יהיה מאוד לשפר את החקירה של הדינמיקה זרימת מים צמח וודי.

Introduction

זמינות של משאבי מים (כלומר, משקעים, תוכן אדמה) קובעת בקפדנות את התמותה ואת ההתפלגות הגיאוגרפית של מינים צמחיים, שכן הם צריכים לקלוט מים מהאדמה ולהעביר אותו לעלים לייצור פוטוסינתטי. הצמחים חייבים לשמור על מערכת התחבורה. המים שלהם תחת תנודות המים בפרט, צמחים וודי ליצור מתחים גבוהים התעלות שלהם לאורך הזרמים דיות כמו, במקרים מסוימים, הם צריכים להחזיק את הכתר שלהם יותר מ ~ 100 m מעל הקרקע. כדי לשמור על עמודי המים בלחץ שלילי כה גבוה, מורכבות התעלות ברצף של תאים צינורי עם קירות תאים קשיחים והידרופוביות מסוג1. הפגיעות בתפקוד הלקוי של המין השני במינים היא הדטרמיננטה טובה של הישרדות המינים תחת אספקתהמים. בנוסף, לימוד מעמד המים של התעלות הוא חשוב להערכת מצבם הבריאותי של העצים הבודדים החשופים ללחצים בריאותיים או ביוטיים. מדידת זרימת sap או פוטנציאל מים יכול לספק הערכות של מעמד המים של צמח וודי בשל הפונקציה הידראולי משולבת של התעלות עצה. יתר על כן, להמחיש את התפלגות המים בתאי עצה יכול להבהיר את המצב של רכיבים בודדים של מערכת הידראולי עצה.

מספר טכניקות להמחיש את מצב המים של התעלות האלה הם3. השיטות הקלאסיות והשימושיות להתבוננות במסלולי המים ברקמת העור כרוכות בצביעת עמודת המים על-ידי הטבאתה בקצות הענפים החתוכים לצבע או על-ידי הזרקת צבע לתוך עץ עומד. צילומי רנטגן רכים מאפשרים גם הדמיה של הפצת מים של דיסקי עץ חתוכים בשל עוצמת הספיגה הדיפרנציאלי של קרני רנטגן של הלחות ב-עצה5,6. שיטות אלו, עם זאת, מספקות רק שירים של תנועת מים או הפגנת הפצות מאקרוסקופי במים. לאחרונה, טכניקות תצפית שאינן הרסניות, כגון מיקרו מיקוד רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (μct)7,8,9,10ודימות תהודה מגנטית (MRI)11, 12, שופרו באופן משמעותי כדי לאפשר השגחה של מים בתוך שתילים שלמים. לשיטות אלה שאינן הרסניות יש יתרונות גדולים בכך שאנו יכולים להתבונן במצב המים של xylem ללא אפקטים מלאכותיים, ואנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של זרימת המים באמצעות הדמיה רציפה או החדרת סוכן ניגודיות10. עם זאת, אנחנו צריכים להשתמש ב-MRI מותאם אישית עבור הדמיה של הצמח או מתקן מיוחד עבור Μסינכרוטרון מבוסס-Ct כדי לקבל את התמונות אשר יכול לזהות תוכן המים ברמה התאית. בנוסף, למרות מערכת μct מבוסס סינכרוטרון לקבל תמונות משובחות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הדומה למיקרוסקופיה קלה7,8,9, תאים חיים יכולים להיפגע על ידי ה קרינה של אנרגיה גבוהה X-ray13,14. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סריקה שבו יחידות ההקפאה מותקנות (ההקפאה-SEM) היא שיטה שימושית מאוד לאיתור בדיוק את המים ב-עצה ברמה התאית, למרות שהדבר דורש לקצור את הדגימה להסתכלות. כדי לתקן את המים ב-עצה, חלק מהגבעולים (כלומר, זרדים, ענפים או גבעולים) קפואים באתרו על ידי חנקן נוזלי (LN2). תצפיות של פני השטח של גזוז, יצורים קפואים על ידי ההקפאה-SEM לספק תמונות מוגדלות ביותר של מבנה עצה שממנו אנו יכולים לזהות את המים ב-עצה כקרח. הגבלה משמעותית של שיטה זו היא כי התבוננות רציפה על מתנוכי המים בתוך אותה דוגמית היא בלתי אפשרית. עם זאת, היישום של μCT או MRI עבור התבוננות רציפה של עצים החיים בשדה הוא מאוד מאתגר משום שמכשירים אלה אינם ניידים. לעומת זאת, לבית-SEM יש פוטנציאל לשימוש בטכניקה זו על עצים גדולים בניסויים בשטח כדי להמחיש בבהירות את תוכן המים במישור הסלולר בלבד, אלא גם ברמת מבנה עדינה יותר, למשל, מים בבורות בין-כלים15, מים ב החללים הבינתאיים16, או בועות בעמודת המים17.

מחקרים רבים התבוננות מים עצה על ידי ההקפאה-SEM דווחו 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi ואח ‘ (1996) הקים בתחילה את הפרוטוקול להתבוננות של עצה באתרו על ידי הקפאת קיבעון של גזע חי באמצעות מילוי LN2 לתוך מיכל להגדיר על גזע21. הטמפרטורה של המדגם נשמרה למטה-20 ° c במהלך איסוף המדגם במהלך הכנת ההקפאה-SEM כדי למנוע המסת הקרח בתוך התעלות עצה. שיטה זו שימש להתבונן במים ב-עצה כדי להבהיר את הפצת המים תחת שינוי משטר המים11,12,24,25,26, 27,28, הווריאציה העונתית של הפצת מים21,29,30, ההשפעה של מחזורים להפשיר הקפאה17,31, 32, התפלגות המים בעץ רטוב5, שינויים בחלוקת המים במהלך המעבר מ סאפרווד לשמוע20, קורס הזמן העונתי של פעילות הקמשוקה והבידול של כלי33, והתוצאה הנגרמת על ידי מתחים ביוטיים מסוימים23,34. מוליכות הידראולית ופגיעות תעלות כדי קוויטציה גם אומתו באמצעות ההקפאה-SEM35,36. המלון שימש לחקר התפלגות אלמנט על פני השטח של מדגם המכיל מים37, והוא מצויד באנרגיה המדלדת בעזרת הספקטרומטריה.

הקפאת קיבוע של גזע חי אשר מכיל תעלות תחת מתח הידראולי גבוה לעיתים גורם cavitations אשר נצפו על ידי המקפיא-SEM כמו גבישי קרח שבורות לומן של תעלות38,39. במיוחד, מינים ברועלים עם תעלות ארוכות ורחבות יותר פגיעים לחפצים הנובעים ממתח, כגון הפחתת החיתוך של המדגם, גם אם בוצעו מתחת למים3,40. הממצאים החזותיים להיות בולט לאחר הדגימה של עץ הטרנס (כלומר, הדגימה בזמן היום) או בתנאים חמורים בצורת והם יכולים להטעות הערכה יתר של מופע מוגזם3,38, 39. לפיכך, יש לשחרר את המתח העובד בתעלות כדי למנוע את האפשרות הארטיטיבית3,12,39.

טכניקת שבר ההקפאה באמצעות סכין מותקן בחדר דגימה מועסק לעתים קרובות כדי לחשוף את משטח הדגימה עבור התבוננות ההקפאה-SEM. עם זאת, הקפאת שבורה מטוסים של רקמות הצמח וודי, במיוחד בחלקים רוחבי של xylem משני, הם גסים מדי כדי להתבונן בבהירות תכונות אנטומית ומים ברקמה6. היישום של קריוסטט עבור זמירה דגימה מאפשר הכנה מהירה ובאיכות גבוהה של משטחים לדוגמה20,23. המטרה הכוללת של שיטה זו היא מתן ראיות עם הרזולוציה אלקטרון מיקרוסקופ של התפלגות המים בסוגים שונים של תאים עצה באתרו ללא התרחשות של חפצי הדגימה. אנו מציגים את ההליך המעודכן שלנו, אשר כבר השתפר בהתמדה מאז שאימצנו אותו לראשונה, לגבי הדגימה, זמירה וניקוי משטח הדגימה להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה של דגימות מתקן ההקפאה של xylem.

Protocol

הערה: תרשים סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. 1. דגימה: הרפיה מתיחות בתוך עמודת המים של קסיאו-תעלות הערה: טיפול ההרפיה הבאה מומלץ לפני היישום LN2 כדי להימנע מהקפאה וממתחים-חפצים המושרה בהפצת המים הקפילאם. הקף ענף ועלים לדיגום עם שקית נ…

Representative Results

תמונות מייצגות של משטחי חיתוך רוחבי של עץ מחטניים וברועלים, שנצפתה על ידי המקפיא-SEM, מוצגים באיור 2. בהגדלה הנמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שמהם המים לחלוטין או בחלקו נעלמים, והאזור האפור מצביע על קירות תא מסוימים, ציטופלסמה ומים (איו…

Discussion

שיטות ההתבוננות ב-“קריו-SEM” שהוצגו במסמך זה מעשיות לצורך המחשה מהירה של חלוקת המים בקנה מידה תאי. באמצעות שיטה זו, לחקור את השינויים בחלוקת המים בתוך עצה יכול לעזור להבהיר את המנגנון של מינים העצים סובלנות ללחץ אביוטיים (מחסור במים או הקפאה) או מתחים ביוטי (מחלת עץ).

הצעד המכרי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI (מ20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04936, 17H03825, 18H02258)

Materials

coating material JOEL Ltd., Japan Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 
cryo scanning electron microscope JOEL Ltd., Japan JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat Thermo Scientific CryoStar NX70
microtome blade Thermo Scientific HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium Thermo Scientific Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006

References

  1. Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
  2. Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
  3. Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
  4. Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
  5. Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
  6. Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
  7. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  8. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
  9. Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
  10. Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
  11. Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
  12. Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
  13. Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
  14. Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
  15. Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
  16. Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
  17. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
  18. McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
  19. Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
  20. Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
  21. Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
  22. Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
  23. Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
  24. Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
  25. Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
  26. Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
  27. Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
  28. Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
  29. Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
  30. Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
  31. Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
  32. Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
  33. Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
  34. Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
  35. Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
  36. Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
  37. Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
  38. Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
  39. Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
  40. Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
  41. Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
  42. Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yazaki, K., Ogasa, M. Y., Kuroda, K., Utsumi, Y., Kitin, P., Sano, Y. Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope. J. Vis. Exp. (148), e59154, doi:10.3791/59154 (2019).

View Video