Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional
Summary
Aislamiento primario de la célula acinar, la modulación de actividad o expresión de la proteína, cultura y últimas aplicaciones son muy útiles en el ex estudio vivo de metaplasia acinar ductal (ADM), un evento temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas.
Abstract
La diferenciación de las células acinares a células ductales durante pancreatitis y en el desarrollo temprano del cáncer de páncreas es un proceso clave que requiere mayor estudio. Para entender los mecanismos de regulación metaplasia acinar ductal (ADM), ex cultura 3D vivo y diferenciación de las células acinares primarias a células ductales ofrece muchas ventajas sobre otros sistemas. Con la técnica aquí, modulación de la expresión de la proteína es simple y rápida, requiere solamente de un día para aislar, estimular o virus infectar y comenzar el cultivo de las células acinares primarias para investigar el proceso ADM. En contraste con utilizando la matriz de la membrana basal, la siembra de racimos de células acinares en colágeno I matriz extracelular, permite a las células acinares conservan su identidad acinar antes de manipulación. Esto es vital cuando la contribución de los diversos componentes para la inducción de la ADM. No sólo son los efectos de citoquinas u otros factores ectopically administrados comprobable a través de esta técnica, pero la contribución de común mutaciones, expresión de la proteína aumento o caída de expresión de la proteína es comprobable a través de la infección viral del primario las células acinares, uso de vectores lentivirales o adenoviral. Además, las células se puede volver a aisladas de colágeno o matriz de la membrana del sótano en el extremo y analizan para la expresión de la proteína.
Introduction
La metaplasia acinar-ductal (ADM) es un mecanismo de protección durante la pancreatitis y un proceso clave de desarrollo de cáncer de páncreas1 que requiere aún más la visión mecanicista de la conducción. Mientras ADM inducida por la inflamación es reversible2, las mutaciones oncogénicas KRAS , que están presentes en el 90% de los casos de cáncer de páncreas3, evitan la diferenciación hacia un fenotipo acinar4,5, 6. cultivo y diferenciando las células acinares primarias en células ductales en cultura 3D permite el estudio de los mecanismos moleculares que regulan el proceso de ADM, que es difícil estudiar en vivo. Tales ex vivo estudios permiten la visualización en tiempo real de ADM, sus conductores y sus reguladores. Se han identificado varios conductores del proceso ADM, así como la visión mecanicista de sus vías de señalización corriente abajo, o verificado usando el aquí descrito método. Estos incluyen inducción de ADM por TGF-α (alfa del factor de crecimiento transformador)-mediada por la expresión de MMP-7 (matriz metaloproteinasa-7) y la activación de ranura7, así como RANTES (regulado en la activación, célula T normal expresado y secretado; también conocido como quimiocina ligando 5 o CCL5) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa)-inducida por ADM a través de la activación de NF-κB (factor nuclear-κB)8. Un mediador adicional de ADM es oncogénico KRas9,10, que provoca un aumento en el estrés oxidativo que mejora el proceso ADM a través del aumento de la expresión de EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) y sus ligandos, EGF ( factor de crecimiento epidérmico) y TGF-α11.
Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de páncreas es común que en estudios in vitro, cultivos de células primarias ofrecen muchas ventajas. Por ejemplo, las células acinares primarias de ratones no transgénicos o ratones que mutaciones iniciadoras, como KrasG12D, son el modelo más apropiado para estudiar el evento temprano de ADM porque las células tienen pocos y controladas las mutaciones, que se sabe que estar presente temprano en el desarrollo de cáncer de páncreas. Esto es a diferencia de muchas líneas celulares de cáncer de páncreas que tienen mutaciones múltiples y variadas de expresión basado en paso número12. Además, las vías de señalización identificadas por estos medios han sido verificadas por estudios en animales. Una advertencia del uso de las células acinares primarias es que no pueden ser transfectadas como líneas celulares de cáncer típica pueden.
El método en el presente documento detalla las técnicas de aislamiento de células acinares, cultura 3D que imita el ADM por adición de estimulantes o modulación de expresión de la proteína vía infección adenoviral o lentivirales, así como la aislamiento de las células en el extremo de mayores análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El relativamente corto período de tiempo de aislamiento, infección y revestimiento primarias células acinares es una ventaja de este método. Por el contrario, cultivo de células acinares de explante consecuencia requiere poco tiempo práctica, pero tarda siete días para la derivación de células acinares13. Un protocolo alternativo para acinar aislamiento14 notas de un método muy corto para la obtención de células acinares; sin embargo, el EGF es un componente ese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención R01 (CA200572) de los NIH a PS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional del cáncer o los institutos nacionales de Health.The donantes no tenían ningún papel en estudiar diseño, recopilación de datos y análisis, decisión publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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