Summary

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Published: January 26, 2019
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Summary

Double-stranded do RNA produzido durante a replicação de vírus de RNA pode ser reconhecido por receptores de reconhecimento padrão para induzir uma resposta imune inata. Para vírus de RNA de sentido negativo, a interação entre o baixo nível de dsRNA e PRRs permanece obscura. Nós desenvolvemos um método de microscopia confocal para visualizar dsRNA arenavírus e PRR em células individuais.

Abstract

(Ds) do RNA double-stranded é produzido como um intermediário replicative durante a infecção de vírus de RNA. Reconhecimento do dsRNA por receptores de reconhecimento de padrão anfitrião (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma proteína associada a diferenciação 5 (MDA-5) leva para a indução da resposta imune inata. A formação e a distribuição intracelular de dsRNA positivo-infecção por vírus de RNA de sentido tem sido bem caracterizada por microscopia. Muitos vírus de RNA de sentido negativo, incluindo alguns arenaviruses, desencadear a resposta imune inata durante a infecção. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo foram pensados para produzir baixos níveis de dsRNA, que impede o estudo da imagem do reconhecimento do PRR do dsRNA viral. Além disso, experimentos de infecção com alta patogenicidade arenaviruses devem ser realizados em instalações de alta contenção biossegurança nível (BSL-4). A interação entre viral RNA e PRRs para alta patogenicidade vírus RNA é desconhecida devido os desafios técnicos adicionais que os investigadores precisam enfrentar nas instalações da BSL-4. Recentemente, um anticorpo monoclonal (Mab) (clone 9 5) originalmente usado para detecção de pan-enterovírus foi encontrado para detectar especificamente dsRNA com uma maior sensibilidade do que os tradicionais anticorpos anti-dsRNA J2 ou K1. Neste documento, utilizando o 9 5 anticorpo, descrevemos um protocolo de microscopia confocal que tem sido usado com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células individuais, infectados por arenavírus. O protocolo é também adequado para estudos de dsRNA e distribuição do PRR em células patogênicas arenavírus infectado em instalações de BSL4 de imagem.

Introduction

O passo inicial da indução da resposta imune inata é acolhimento reconhecimento de double-stranded do RNA (ds) por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma associada a diferenciação proteína 5 (MDA-5)1. Para vírus de RNA de sentido positivo, dsRNA pode geralmente ser prontamente detectado usando o J2 ou K1 anti-dsRNA antibodies monoclonal (Mab)2. Interação entre dsRNA e PRRs em vírus de RNA positivo-vertente, como picornavírus, tem sido caracterizada utilizando microscopia confocal3. No entanto, para vírus de RNA sentido negativo, visualização e caracterização do PRR e dsRNA interação tem sido dificultado pela ausência de anticorpos sensíveis ao dsRNA. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de RNA foi aplicada para a visualização de viral RNA e PRRs4. No entanto, a metodologia de peixe requer o conhecimento do destino sequência de RNA e pode não ser compatível com PRR co coloração. Recentemente, a 5 de 9 Mab, que foi originalmente desenvolvido para o diagnóstico da infecção por enterovírus-pan, foi encontrado para ser mais sensível do que o Mab J2 e pode facilmente detectar dsRNA no sentido negativo de5,de infecção de vírus de RNA6. Assim, o Mab 9 5 é um romance e uma ferramenta útil para estudar a replicação viral e a interação entre o PRR e o RNA viral para vírus de RNA sentido negativo.

Arenaviruses é uma família de vírus de RNA de single-stranded, negativo-sentido, que inclui vários agentes patogénicos humanos, tais como vírus de Lassa (LASV), vírus Junín (JUNV) e vírus Machupo (MACV), que causam doenças graves de febre hemorrágica em seres humanos7. Dados clínicos de casos graves e fatais de febre hemorrágica Argentina causada por arenavírus do novo mundo JUNV apresentam níveis anormalmente altos de soro IFN-α8,9. Mostramos que o arenaviruses NW patogénicos (JUNV e MACV), mas não a patogenicidade velho mundo arenavírus, LASV, induzem um tipo eu resposta de interferon (IFN) em humanos células dendríticas derivadas de monócitos10. Além disso, RIG-I é um dos sensores mediando tipo I resposta IFN em células infectadas JUNV11. Também achamos que o receptor de R (PKR) proteína quinase, que é tradicionalmente conhecido por reconhecimento de dsRNA, é ativado em patogenicidade NW arenavírus infecção12. Para entender melhor o mecanismo de resposta IFN vírus específicos durante a infecção arenavírus, visamos desenvolver um protocolo para visualizar a interação entre dsRNA viral e os PRRs citoplasmáticas.

Experimentos de infecção com patogenicidade JUNV, MACV e LASV precisam ser executada em Biossegurança nível 4 instalações (BSL-4). Assim, além do nível baixo presumivelmente de dsRNA formado na infecção por arenavírus, cumprindo as exigências de biossegurança é outro desafio técnica ao realizar estudos de imagiologia para estes vírus de alta patogenicidade. Utilizando o 9 5 anticorpo e Candid1 # estirpe utilizada na vacina de JUNV, um protocolo baseado em microscopia confocal é descrito neste relatório, que tem sido usada com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células infectadas por arenavírus em BSL2 laboratórios. O protocolo é também adequado para visualização da distribuição intracelular de dsRNA e PRR durante infecção patogénica arenavírus em instalações de BSL4.

Protocol

1. preparação de células A549 e infecção JUNV Semente de 2 x 105 pulmão humano A549 células epiteliais em poli-D-lisina (PDL) revestido as lamelas de vidro em placas boas 12 24 horas antes da infecção. Preparar alíquotas de 150 mL de JUNV13 em uma multiplicação de infecção (MOI) de 1,0 placa formando unidade por célula diluída em mídia de médio (DMEM) modificado Eagle de Dulbecco suplementada com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e es…

Representative Results

Este protocolo foi aplicado para estudar a distribuição e o colocalization entre os RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA em células infectadas por JUNV. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2, a acumulação de dsRNA aumenta ao longo do tempo como progride de infecção viral. Concentrado de MDA-5 (Figura 1) e equipamento-(Figura 2) sinais foram encontrados colocalized com as e…

Discussion

Para vírus de RNA de sentido positivo e vírus dsDNA, dsRNA é facilmente detectado com o anticorpo utilizado de anti-dsRNA J2. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo acredita-se que produzem o dsRNA em uma baixa ou abaixo do nível de detecção, usando o mesmo anticorpo2. Assim, muitos aspectos da interação viral do RNA e PRR são em grande parte obscuro para vírus de RNA de sentido negativo. Buscou-se mancha para dsRNA na infecção por arenavírus usando o anticorpo J2 mas os sinais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o UTMB imagem núcleo instalações e Maxim Ivannikov para assistência de microscópio.

Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública conceder RO1AI093445 e RO1AI129198 para SP, premiado UTMB compromisso fundo P84373 de CH e T32 AI007526 para EM.

Materials

APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit Invitrogen A10475
BSA Sigma Aldrich A4503
DAPI Cell Signaling 4083 1:1,000 dilution
Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen A-11058 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437
Dulbecco's modified Eagle's medium Corning 10-013-CV
Fetal Bovine Serum Atlanta Bio S11150
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11029 1:2000 dilution; Lot #: 1874804
Human lung epithelial A549 cells ATCC CCL-185
Methanol Fisher A412 Stored at -20 °C
Mouse MAb anti-JUNV NP BEI NA05-AG12 Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution
Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent Millipore Sigma 3361 ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445
PBS supplemented with Ca and Mg Corning 21-030-CV
PDL Coated coverslips Neuvitro H-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifade Invitrogen P10144
Rabbit MAb MDA-5 Abcam ab126630 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7
recombiant Candid#1 strain of JUNV Lab generated Lab generated As previously described in reference 13.
RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 Santa Cruz sc-376845 1:1000 dilution; Lot #: AO218
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 

References

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Cite This Article
Mateer, E., Paessler, S., Huang, C. Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (143), e59095, doi:10.3791/59095 (2019).

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