Summary

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Abstract

항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.

Introduction

임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftriaxone 및 azithromycin9,10, 함께 무 증상 감염의 증가 실패 임 질 치료 실패를 이해 하기 위한 필요를 강조 한다.

한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 최소 억제 농도 (MIC) 테스트는 항생제에 저항을 식별에 대 한 표준 의학 시험으로 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마이크 테스트 세균성 항 생 저항 vivo에서 반영 하는 경우에 명확 하지 않습니다. 항생제의 살 균 농도의 박테리아의 생존에 기여 하는 박테리아 biofilms의 형성: 마이크 테스트 하는 것은이 효과11을 감지할 수. GC는12점 막 표면 biofilms을 형성할 수 있다, 때문에 우리가 가설 그 항생제 자화 율 집계 내 개별 GC에서 본 다른 것. 또한, 연구 3 상 가변 표면 분자, Pili, 불투명도 관련 단백질 (Opa), 및 lipooligosaccharides (로스), 규제 간 박테리아 상호 작용, 다른 크기의 집계13, 으로 이어질 14 , 15. 항생제 저항에 이러한 구성의 기여 적절 한 방법의 부족으로 검사 하지.

현재, biofilm 박멸을 측정 하기 위해 여러 가지 방법이 있다. 가장 널리 사용 되는 양적 방법 크리스탈 바이올렛16얼룩을 사용 하 여 바이오 매스의 변화를 측정 하는 것입니다. 그러나, 방법 중요 한 실험적인 조작 실험 반복17에서 잠재적으로 오류를 생성할 수 있는 필요 합니다. 여기에 사용 되는 라이브/죽은 착 방법 라이브 하 고 죽은 박테리아와 그들의 분포는 biofilm 내의 시각화 수 있습니다. 그러나, biofilm 구조의 염료 침투를 감소 시키는 물리적 장벽으로 발생할 수 있습니다. 따라서, 그룹 내에서 라이브/죽은 박테리아를 계량 하는 얼룩 작은 biofilms 또는 그것의 선구자-microcolonies 또는 집계로 제한 됩니다. 다른 방법을, 한 천 희석 및 디스크 확산 테스트를 포함 하 여 집단의 효과 측정할 수 없습니다. 것 필요 모두를 측정할 수 있는 정량적 분석 결과 박테리아 생활과 그들의 분포를 시각화 항생제 노출, 이상적인 방법 집계에서 GC 민감성을 검사 합니다.

여기에 설명 된 절차는 ATP 사용률 측정 결합 및 라이브/죽은 얼룩을 양적 분석 결과 항생제의 집계에서 GC 민감성을 시각적으로 검사.

Protocol

1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종 N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그18 (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO2 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다. 신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) ?…

Representative Results

두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + …

Discussion

박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 “첫 해 혁신 및 연구 경험” 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.

Materials

100x Kellogg's supplement
Agar United States Biological A0930
BacTiter Assay  Promega G8232
Ceftriaxone TCI C2226
Difco GC medium base  BD 228950
Ferric nitrate, nonahydrate  Sigma-Aldrich 254223-10G
Glucose Thermo Fisher Scientific BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder Fisher Scientific BP379-100
BacLight live/dead staining Invitrogen L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP329-1
Proteose Peptone  BD Biosciences 211693
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-10
Soluble Starch Sigma-Aldrich S9765
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754-5G
Equipment
Petri Dishes VWR 25384-302
8-well coverslip-bottom chamber  Thermo Fisher Scientific 155411
96-well tissue culture plates  Corning, Falcon 3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) Nuaire 32776
CO2 Incubator Fisher Scientific  Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber Leica SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate  Corning 3904
Glomax Illuminator  Promega E6521
Pipette tips (0.1-10 µL) Thermo Fisher Scientific 02-717-133
Pipette tips (1000 µL) VWR 83007-382
Pipette tips (200 µL) VWR 53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV Pharmacia Biotech 80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes VWR 21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) Sorenson BioScience 16070
Sterile polyester-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-122
Sonicator Kontes Equivelent to 9110001

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Cite This Article
Wang, L., Wagner, J., Capino, A., Nesbit, E., Song, W., Stein, D. C. Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining. J. Vis. Exp. (144), e58978, doi:10.3791/58978 (2019).

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