Summary

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Published: March 05, 2019
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Abstract

Caracterización de células inmunitarias se basa pesadamente multicolor por citometría de flujo para identificar subpoblaciones basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie. Instalación de un panel multicolor clásico requiere instrumentos High-End, anticuerpos etiquetados personalizados y cuidadoso estudio diseño para minimizar la superposición espectral. Hemos desarrollado un análisis multiparamétrico para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en sangre periférica mediante la combinación de siete marcadores de linaje utilizando sólo dos fluorocromos. Nuestra estrategia se basa en la observación que los marcadores de linaje se expresan constantemente en una combinación única por cada población celular. Combinando esta información con una cuidadosa titulación de los anticuerpos permite a los investigadores grabar cinco marcadores adicionales, ampliando el límite óptico de la mayoría los citómetros de flujo. Comparación directa demostró que la gran mayoría de las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica puede ser caracterizada con precisión comparable entre nuestro método y el “un marcador fluorocromo y un enfoque clásico”, aunque este último sigue siendo más precisos para la identificación de las poblaciones, como las células NKT y células de T del γδ. La combinación de siete marcadores con dos fluorocromos permite el análisis de poblaciones celulares inmunes complejos y muestras clínicas en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 e incluso en 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo. Este enfoque es también muy adecuado para la detección de varias poblaciones de la célula en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

Introduction

Citometría de flujo es una técnica que fue desarrollada para analizar varios parámetros en solas partículas a una velocidad de varios miles de sucesos por segundo1. Ejemplos de muestras analizadas por citometría de flujo incluyen, pero no se limitan a, las células, los granos, bacterias, vesículas y cromosomas. Un sistema fluídico dirige las partículas en el punto de interrogación donde cada partícula cruza su camino con uno o más láseres, y varios parámetros son grabados para su posterior análisis. Scatter delantero y lateral, generado por la dispersión de la luz láser puro, se utiliza para identificar la población objetivo y recuperar información sobre el tamaño relativo y la complejidad interna/granularidad de las partículas, respectivamente. Todos los otros parámetros, que representan la mayor parte de los datos en un análisis de citometría de flujo, se derivan por sondas marcadas con el fluorocromo que reconocen y se unen a objetivos específicos en las partículas de interés.

Citometría de flujo es una herramienta primaria para estudios inmunológicos identificar y caracterizar poblaciones celulares. Para diseccionar la complejidad del sistema inmune, paneles multicoloras evolucionan constantemente para ampliar el número de marcadores simultáneamente grabada para profunda Inmunofenotipificación de poblaciones de células1. Esto conduce al desarrollo de los instrumentos más capaces y fluorocromos, con citómetros de flujo gama alta reciente superior a 20 parámetros fluorescentes. El resultado en el diseño de estudio complejo debido a la superposición espectral fluorocromo y en costes más altos asociados con encargo anticuerpo etiquetado y calificados operadores. En varios casos, complejidad y los costes se reducen mediante el uso de distintos paneles de marcadores de diferentes poblaciones celulares. Este enfoque, sin embargo, es propenso a errores, reduce la información en cada panel y puede ser difícil de aplicar a las muestras con número limitado de células. Por otra parte, aumentar el número de marcadores excluye immunophenotyping profunda en los instrumentos con menos parámetros fluorescentes. Previamente hemos desarrollado un protocolo de tinción para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la combinación de siete marcadores de linaje mediante sólo dos fluorocromos en lugar de los siete necesarios usando el tradicional “un marcador fluorocromo y un” enfoque (www.hcdm.org)2,3. Nuestro informe inicial había explorado y había validado la noción de combinar siete marcadores de dos fluorocromos de immunophenotyping profundo. En este informe, presentamos un protocolo paso a paso para aislar y la tinción de células sanguíneas periféricas, centrándose en el aspecto práctico y solución de problemas de pasos para lograr una acertada coloración.

Este protocolo se basa en la observación que marcadores de linaje tienen una expresión constante en la superficie celular y que cada población celular tiene una exclusiva combinación de marcadores de linaje. En PBMCs, expresión de CD3 subdivide las células inmunes en dos categorías principales: los linfocitos T CD3-positive y células CD3 negativas. Dentro del subgrupo positivo de CD3, CD4+, CD8+ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente. En un enfoque de un fluorocromo marcador uno estándar, anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-CD19, CD56 y – TCR γδ los anticuerpos se detectan con siete diferentes fluorocromos. Nuestro enfoque combina anti-CD3, CD56 y – TCR γδ anticuerpos en un fluorocromo (designada para el fluorocromo de conveniencia A) y anti-CD4,-CD8, CD14 y – CD19 anticuerpos en un fluorocromo diferente (fluorocromo B). Esto es posible por una combinación de valoración de anticuerpos y antígeno diferencial expresión. Ambos CD4+ y CD8+ T las células son positivas para el anticuerpo anti-CD3 en fluorocromo A, pero se pueden separar en fluorocromo B maximizar la expresión de la señal de CD8 colocando con una titulación especial, la señal de CD4 entre el CD8 y las células de CD3 positivo-CD4/CD8 dobles negativas. Las células de T del γδ expresa mayor nivel de CD3, CD4 y CD8, y por lo tanto pueden ser identificados como CD3 alto4. Esta señal es impulsada más por etiquetado γδ células de T en fluorocromo A con un anti-TCR γδ los anticuerpos, mejorando la separación entre células T baja de CD3 y células Tγδ alta T de CD3. Las células de B pueden identificarse como CD3 en el fluorocromo A y CD19+ en fluorocromo B. Para separar las células NK negativo CD3 de células B, fue utilizado un anticuerpo anti-CD56 en fluorocromo A como anti-CD3. Esto es posible porque expresa CD56 de células NK en un nivel mucho más bajo que el CD3 en células T5. Finalmente, los monocitos pueden ser identificados mediante una combinación de propiedades de dispersión hacia delante-lateral y expresión de CD14 en fluorocromo B.

La idea de combinar hasta cuatro marcadores con dos fluorocromos se ha intentado con éxito antes de6,7,8y se ha utilizado en un protocolo clínico para identificar poblaciones linfocíticas malignas9 . Un informe anterior también combinado siete marcadores (con diferente especificidad de los marcadores que utilizamos en nuestro protocolo) usando dos fluorocromos, pero ello dependía de un complejo etiquetado de cada anticuerpo con diferente cantidad de fluorocromo10. Esto está en contraste con el método que utiliza anticuerpos comercialmente disponibles y puede ser adaptado a la configuración del equipo y puede tomar ventaja de la nueva generación de fluorocromos de polímero.

El objetivo general de esta metodología es ampliar los límites ópticos de mayoría citómetros de flujo, permitiendo la grabación de cinco marcadores adicionales para interrogar a las poblaciones de la célula compleja. Como consecuencia, análisis inmunológicos avanzado pueden realizarse en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 y 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo pueden lograr resultados notables en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo y crear flujo modular cytometric paneles dirigidos a varios linajes en el mismo tiempo11. Esto puede potencialmente reducir el número de paneles utilizados en citometría de flujo immunophenotyping modular y reducir los costos, errores y tiempo de manipulación. Este enfoque es también muy adecuado en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.

Protocol

Todos los estudios de materiales humanos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Johns Hopkins bajo la Health Insurance Portability y Accountability Act. Muestras de paciente y control fueron anónima. PBMCs y sangre de controles sanos se obtuvieron mediante consentimiento informado. Nota: Este protocolo ha sido probado en recién o congeladas aisladas células de sangre periféricas y sangre entera. 1. preparación de la célula</…

Representative Results

Configuración y análisis de un experimento de citometría de flujo de células humanas de sangre periféricas teñidas con siete marcadores de linaje (anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-anticuerpos de CD19, CD56 y – TCR γδ) usando sólo dos fluorocromos se presentan. Se describen resultados representativos para anti-CD8 y – CD56 titulación de anticuerpos. Para cada anticuerpo (en este ejemplo, anti-CD8), se registraron datos de diez …

Discussion

El protocolo presentado aquí se ha demostrado para ser bastante flexible e insensible a los cambios en la coloración de tampón, la temperatura y la preparación de células de sangre periférica debido a la alta expresión de marcadores de linaje en la superficie celular. El paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad, es la titulación de anticuerpos. De la nota, ya que la titulación de anticuerpos debe realizarse siempre durante la instalación de un panel de citometría de flujo, este pas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel, , Premio número P30-AR053503; La Fundación más estable, www.stablerfoundation.org; Nacional Instituto de alergias y enfermedades infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Programa de Irlanda de Nina para la salud pulmonar (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Materials

CD3 BD Biosciences 562426 Antibody for staining
RRID: AB_11152082
CD56 BD Biosciences 562751 Antibody for staining
RRID: AB_2732054
TCRgd BD Biosciences 331217 Antibody for staining
RRID: AB_2562316
CD4 BD Biosciences 555347 Antibody for staining
RRID: AB_395752
CD8 BD Biosciences 555367 Antibody for staining
RRID: AB_395770
CD14 BD Biosciences 555398 Antibody for staining
RRID: AB_395799
CD19 BD Biosciences 555413 Antibody for staining
RRID: AB_395813
CD3 BD Biosciences 555335 Antibody for staining
RRID: AB_398591
CD56 BD Biosciences 555518 Antibody for staining
RRID: AB_398601
TCRgd BD Biosciences 331211 Antibody for staining
RRID: AB_1089215
CCR7 Biolegend 353217 Antibody for staining
RRID: AB_10913812
CD45RA BD Biosciences 560674 Antibody for staining
RRID: AB_1727497
CCR4 BD Biosciences 561034 Antibody for staining
RRID: AB_10563066
CCR6 BD Biosciences 353419 Antibody for staining
RRID: AB_11124539
CXCR3 BD Biosciences 561730 Antibody for staining
RRID: AB_10894207
CD57 BD Biosciences 562488 Antibody for staining
RRID: AB_2737625
HLA-DR BD Biosciences 563083 Antibody for staining
RRID: AB_2737994
CD16 BD Biosciences 563784 Antibody for staining
RRID: AB_2744293
Dead cells Life technologies L-23105 Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap BD Bioscience 352235 to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube BD Bioscience 352001 to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo fisher 12648010 Freezing cells
96-well V-bottom plate Thermo fisher 249570 plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences Flow cytometer
FCS Express 6 De Novo Software FACS analysis
Graphpad Prism GraphPad software Data analysis

References

  1. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
  2. Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
  3. Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
  4. Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
  5. Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
  6. Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
  7. Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
  8. Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
  9. Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
  10. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
  11. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
  12. Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
  13. Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
  14. Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
  15. Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
  16. Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
  17. Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
  18. Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
  19. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
  20. Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
  21. Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
  22. Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
  23. Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
  24. Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
  25. Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
  26. Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).

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Torchia, M. L. G., Cimbro, R. Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (145), e58955, doi:10.3791/58955 (2019).

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