Enquête bio-énergétique en temps réel à l’aide de Candida albicans analyse extracellulaire de Flux
Summary
Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels pour le métabolisme cellulaire et la survie. Une variété d’événements importants se déroulent dans les mitochondries, telles que la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose. Par conséquent, dysfonctionnement mitochondrial est signalé à jouer un rôle important dans la tolérance des médicaments antifongiques et la virulence des champignons pathogènes. Des données récentes ont également conduit à la reconnaissance de l’importance des mitochondries comme un important contributeur à la pathogénèse fongique. Malgré l’importance des mitochondries en biologie fongique, des méthodes normalisées pour comprendre sa fonction sont peu développés. Nous présentons ici une procédure afin d’étudier le taux de consommation d’oxygène basale (OCR), une mesure de la respiration mitochondriale et taux d’acidification extracellulaire (ECAR), une mesure de la fonction glycolytique chez les souches de c. albicans . La méthode décrite ci-après peut être appliquée à n’importe quel Candidaspp. souches sans la nécessité de purifier les mitochondries des cellules fongiques intacts. En outre, ce protocole peut également être personnalisé pour dépister les inhibiteurs de la fonction mitochondriale chez les souches de c. albicans .
Introduction
Infections fongiques invasives tuent plus 1,5 millions de personnes par an dans le monde entier. Ce chiffre est en hausse en raison d’une augmentation du nombre de personnes vivant avec l’immunité compromise, y compris les nourrissons prématurés âgés, receveurs et cancer patients1. C. albicans est un pathogène opportuniste qui fait partie de la microflore humaine. Il habite également les surfaces muqueuses et le système gastro-intestinal comme un organisme commensal. C. albicans produit une maladie systémique grave chez les personnes ayant des déficiences immunitaires, qui ont subi une chirurgie, ou qui ont été traités avec longs cours des antibiotiques. Le rang d’espèce Candida parmi les causes de trois à quatre premiers nosocomiales maladies infectieuses (NID) sur les êtres humains2,3,4,5,6,7. Le nombre global annuel des septicémies à Candida est estimé à ~ 400 000 cas, avec des taux de mortalité associé de 46 à 75 %1. La mortalité annuelle à cause de la candidose est d’environ 10 000 dans les seuls États-Unis. L’ampleur du NID causée par des champignons se reflète également dans astronomique dépenses patient5. Aux États-Unis, les dépenses annuelles pour le traitement des infections fongiques invasives dépasse $ 2 milliards, ajoutant une énorme souche au système de santé déjà surchargé. Actuellement, les traitements antifongiques standards disponibles sont limitées en raison de la toxicité, la résistance aux médicaments de plus en plus répandue et interactions médicament-médicament. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier de nouvelles cibles de médicaments antifongiques qui seront traduira par meilleures options de traitement pour les patients à haut risque. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments agissant sur les cibles fongiques est compliquée car les champignons sont des eucaryotes. Ce qui limite considérablement le nombre de cibles thérapeutiques spécifiques fongiques.
Des études récentes ont montré que les mitochondries sont un facteur critique de la virulence fongique et la tolérance aux médicaments antifongiques puisque les mitochondries sont importants pour la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose8 ,9,10,11. Le métabolisme glycolytique et non-glycolytiques sont essentiels pour la survie de c. albicans dans le mammifère hôte12,13,14,15,16. En outre, plusieurs mutants de c. albicans , manque de protéines mitochondriales, tels que Goa1, Srr1, Gem1, etc. Sam37 montrent défectueux dans la filamentation, un facteur de virulence important de c. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. en outre, ces mutants ont été également montrés pour être atténuée pour virulence dans un modèle murin de diffusé la candidose17,18,19,20,21 ,,22. Ainsi, des mitochondries fongiques représentent une cible attractive pour la découverte de médicaments. Cependant, l’étude de la fonction mitochondriale chez c. albicans est difficile parce que c. albicans est petite négative23, ce qui signifie qu’il ne peut survivre sans le génome mitochondrial.
Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier la fonction mitochondriale et glycolytique chez c. albicans sans la nécessité de purifier des mitochondries. Cette méthode peut également être optimisée pour étudier l’effet de la manipulation génétique ou les modulateurs chimiques sur des voies mitochondriales et glycolytiques chez c. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
La bioénergétique test flux supplémentaire est un outil excellent pour donner lecture de la fonction mitochondriale en mesurant la phosphorylation oxydative (OXPHOS)-dépendante d’oxygéne en temps réel. En outre, une fonction glycolytique qui est mesurée sous forme d’un taux d’acidification extracellulaire (modification du pH extracellulaire) peut également être étudiée en même temps dans l’analyse en temps réel.
Électrodéposition réussie de c. albicans dans la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche dans le laboratoire de NC est soutenue par une subvention du National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 et une subvention de la Fondation New Jersey de la santé (NJHF), #PC40-18.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito stress kit | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Sodium Chloride | Amresco | 241 | |
| Sodium hydroxie pellets | J.T Baker | 3722 | |
| Tissue culture grade water | Gibco | 1523-0147 | |
| XF assay calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose | Fisher scientific, | BP2469 | |
| Yeast extract Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Yeast extract Peptone Glycerol | Sigma | G2025 |
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