Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay
Summary
Измерение холестерина в пробирке измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является перспективным средством как биомаркер для атеросклероза. В настоящем исследовании мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Abstract
Атеросклероз приводит к сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). До сих пор неясно, является ли концентрации холестерина ЛПВП (cHDL) играет причинную роль в развитии атеросклероза. Однако, важным фактором в ранних стадиях формирования атеромы доска является способности измеряем холестерина ЛПВП (способность HDL частиц принять холестерина из макрофагов) для того, чтобы избежать образование клеток пены. Это ключевой шаг в избегая накопление холестерина в эндотелия и частью обратного холестерина транспорта (РКИ), чтобы устранить холестерина через печень. Холестерин измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является многообещающим инструментом, который может использоваться в качестве биомаркеров для атеросклероза. Традиционно [3H]-холестерина был использован в холестерин измеряем анализов. В этом исследовании мы стремимся разработать стратегию безопаснее и быстрее, с использованием флуоресцентных помечены холестерина (NBD-холестерин) в клеточном assay проследить процесс поглощения и измеряем холестерина в THP-1-производные макрофагов. Наконец мы оптимизации и стандартизировать метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения текущий главных причин смерти во всем мире являются ишемическая болезнь сердца и инсульта (приходится в общей сложности 15,2 миллиона смертей)1. Оба являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые могут предшествовать атеросклероза и разрыв атеромы бляшки в сосудах2,3.
Атеросклероз является судно стены воспалительное заболевание в котором макрофагов, Т-клетки, тучные клетки и дендритных клеток проникнуть эндотелия и накапливаются в крови, в конечном итоге формирование атеросклеротических бляшек. Атеросклеротические бляшки представляют липидного ядра и холестерина кристаллы, подтверждается разрешением измерения B-режим УЗИ сонных интима медиа толщина4,5. В макрофагах холестерин измеряем сторону липидов акцептора частиц осуществляется средствами СПС привязки кассеты (ABC) рецепторов ABCA1, АТФ привязки кассеты член subfamily G 1 (ABCG1), и мусорщик рецептор SR-Би. Дисбаланс приток холестерина и измеряем в макрофагах считается ключевой процесс атеросклероза инициации6. Холестерин измеряем считается ключевым шагом в ликвидации холестерина от периферических тканей к плазме крови и печени в процессе, называемом обратный холестерина транспорта (РКИ). Холестерин переносится из макрофагов, главным образом для Аполипопротеин А1 (ApoA1) на поверхности частиц липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). HDL затем транспорт холестерина в печени для выведения и повторного использования7,8,9.
Традиционно тритий (3H) цианокобаламина, меченного холестерин используется в холестерин измеряем10. Сигнал выбросов радиоизотопов является весьма деликатным10; Однако цианокобаламина, меченного холестерин представляет очевидные недостатки как долго протоколы, риска воздействия ионизирующего излучения и потребность в специальных радиоактивности объектов и оборудования для обеспечения безопасной обработки радиоактивных выбросов. Напротив флуоресценции была успешно включена в методы диагностики благодаря своей простоте в флуоресцентного сигнала, широкий спектр доступных флуорофоров и ее безопасности11. Несколько флуоресцентные, меченного стерины были использованы для изучения метаболизма холестерина включая dehydroergosterol (с внутренней флуоресценции), Дансил холестерина, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – холестерин и 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-холестерин). В частности НБД холестерин представляет эффективное усвоение в клетки человека12. В настоящее время имеются два различных NBD помечены холестерин: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) и 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-НБД; Рисунок 1). Холестерин, помечены 22-NBD остаток может лучше всего подходят для исследования измеряем холестерина, в то время как 25-NBD-холестерин используется главным образом в клеточной мембраны динамика исследований13,14.
Линии клетки обычно используется в пробирке холестерина измеряем анализов являются Моноцит подобных клеток, таких как клетки человека лейкоз производные THP-1, мышиных Raw 264.7 клетки15или J774.1. Все эти клетки могут быть дифференцированы в макрофагов в пробирке с использованием phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA), но THP-1-производные макрофагов (dmTHP-1) лучший отражают и имитировать человека макрофаги16.
В настоящем исследовании, мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод высокой пропускной способностью для определения способности измеряем холестерина сыворотки образцов на dmTHP-1, используя 22-NBD-холестерина в качестве альтернативы [3H]-холестерина. Кроме того мы сравниваем оптимизированный флуоресцентные технику с стандартного аналогового радиоактивных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Флуоресцентные, меченного холестерин является перспективной стратегией для анализа и изучения свойств и метаболизма природных холестерина в пробирке. Его основными преимуществами являются, что он может быть take up клетки, позволяет для внутриклеточного и мембраны исследования распред…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается исследовательских грантов FIS (PS12/00866) из Instituto de Salud Карлоса III, Мадрид, Испания; Fondo Europeo Comisión para el Desarrollo региональных (ФЕДЕР); Красный де инвестигасьон en СИДА (рис), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) и CERCA программы / Женералитата Каталонии. Авторы благодарят Retrovirology и вирусная лаборатория иммунопатологии Institut d’Investigacions Pi Biomèdiques августа I Сунийе (IDIBAPS). Мы благодарим т. Escribà, C. Ровира и C. Уртадо за их помощь и S. Cufí от знания и технологии передачи управления за ее руководство в деле защиты изобретения.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
References
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
