Summary

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

Published: January 09, 2019
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Summary

Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.

Abstract

Le cellule T utilizzano programmi metabolici differenti per soddisfare le loro esigenze funzionale durante il differenziamento e la proliferazione. I mitocondri sono componenti cruciali cellulare responsabile della fornitura di energia delle cellule; Tuttavia, i mitocondri in eccesso producono anche le specie reattive dell’ossigeno (ROS) che potrebbero causare la morte delle cellule. Di conseguenza, il numero dei mitocondri costantemente deve essere regolato per soddisfare le esigenze delle cellule. Questa regolazione dinamica avviene in parte attraverso la funzione dei lisosomi che rimuovere macromolecole e organelli avanzo/danneggiato. Quindi, il contenuto cellulare di lisosomiale e mitocondriale è indicatori chiave per valutare la regolazione metabolica delle cellule. Con lo sviluppo di sonde per organelli, lisosoma ben caratterizzato o mitocondri specifici coloranti sono diventati disponibili in vari formati per etichettare i mitocondri e lisosomi cellulari. Citometria a flusso multicolor è uno strumento comune per fenotipi cellulari di profilo e ha la capacità di essere integrato con altri dosaggi. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato di come combinare organello specifici coloranti con marcatori di superficie macchiatura per misurare la quantità dei lisosomi e dei mitocondri in popolazioni differenti delle cellule T su un citometro a flusso.

Introduction

L’attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell’attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l’induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l’enorme richiesta metabolica durante la proliferazione e differenziazione cellulare. Le cellule che non riescono a seguire attraverso il fabbisogno metabolico die da apoptosi1,2. Durante la riprogrammazione metabolico, i mitocondri svolgono un ruolo importante poiché essi sono gli organelli in gran parte responsabili per la produzione di ATP per la fornitura di energia per la cellula, e il contenuto di mitocondri cellulari fluttua durante il metabolici interruttori in tutto cellula T sviluppo e attivazione3. Tuttavia, l’accumulo di mitocondri superflui o danneggiati possa produrre ROS in eccesso che danneggiare lipidi, proteine e DNA e può finalmente condurre a cellule morte4

I mitocondri danneggiati o eccessivi derivanti da alterazioni metaboliche vengono rimossi da una forma specializzata di autofagia5, noto come mitophagy. I mitocondri sono avvolto da autofagosomi e quindi fusi con i lisosomi per la degradazione. Questi vicino comunicazioni tra mitocondri e lisosomi hanno generato grande interesse6,7. Ad esempio, lo sforzo ossidativo stimola i mitocondri per formare vescicole mitocondri-derivato (MDVs) che sono mirate al lisosomi per la degradazione in un omologo fosfatasi e tensin (PTEN)-indotto putativa chinasi 1 (PINK1) e parkin (una E3 ubiquitina ligasi) modo dipendente8. È emerso inoltre che mitophagy è essenziale per la transizione dell’adipocita bianco-beige9,10. Ancora più importante, i lisosomi non sono semplicemente un vano di degrado, ma anche un regolatore di segnalazione cellulare. Accumulo eccessivo di substrato a causa di carenze di enzima provoca la disfunzione lysosomal interrompendo la permeabilità della membrana lisosomiale e colpisce il Ca2 + omeostasi11. Difetti funzionali delle cellule T in lipasi acida lysosomal (LAL)12 o metabolita lysosomal transporter knockout mouse modello13 ha mostrato ulteriormente l’importanza dei lisosomi nel mantenimento dell’omeostasi delle cellule T. Sia i mitocondri ed i lisosomi sono parti inseparabili di regolazione metabolica cellulare. Misura del contenuto cellulare mitocondriale è stato quindi un indicatore fondamentale per valutare lo stato metabolico e funzionale di cellule T.

Analisi comunemente usate per quantificare il contenuto cellulare mitocondriale o lysosomal includono immunoblot, microscopia elettronica, colorazione di immunofluorescenza (IF) e l’analisi PCR di mitocondriale del DNA copia numeri14,15, 16. mentre immunoblot quantitativamente è in grado di confrontare i livelli della proteina attraverso diversi campioni ed elettrone o se microscopia può visualizzare le caratteristiche morfologiche di questi organelli17, questi saggi sopportano alcuni inconvenienti tecnici. Ad esempio, è molto tempo per acquisire sufficiente numero di cellulare immagini con alto ingrandimento e risoluzione o per confrontare i livelli di espressione di una proteina attraverso decine di campioni, rendendo questi saggi considerati metodi di basso rendimento. Inoltre, queste analisi possono essere applicate solo a popolazione omogenea delle cellule, ad esempio linee cellulari, ma non per i campioni di tessuto che sono composte da popolazioni miste.

È anche difficile applicare tali saggi a popolazioni rari, per cui il requisito di cellule minimal numeri da 106 -108 è impossibile da rispettare. Infine, le cellule sono solitamente lisate o fisso durante il processo, rendendoli incompatibili con altri metodi per estrarre ulteriori informazioni. Rispetto ai metodi tradizionali, basati su fluorescente flusso cytometry ha un relativamente alto throughput – le informazioni di tutte le celle all’interno di un campione composto da popolazioni miste di cellule possono essere analizzate e raccolti simultaneamente. In più, uno in grado di rilevare più di 10 parametri sulla stessa cellula e ordinare le celle basate sui fenotipi desiderati per ulteriori analisi. Sonde fluorescenti reattivi sono stati usati per etichettare i lisosomi e mitocondri in cellule vive e possono essere rilevati da flusso cytometry18,19. Queste sonde di organelli specifici sono cellulare permeabile e hanno caratteristiche fisico-chimiche che permettono loro di essere concentrata in determinate località subcellulare o organelli. Convenientemente, queste sonde sono disponibili in vari formati fluorescenti, permettendo così la loro applicazione per l’analisi multicolor.

Questo protocollo viene descritto in dettaglio come combinare marcatore di superficie colorazione con coloranti specifici lisosoma o mitocondri lisosomi etichetta o mitocondri in cellule vivono. Ciò è particolarmente utile per campioni generati da tessuti primari e gli organi, che sono spesso composte da popolazioni eterogenee delle cellule. Ricercatori è in grado di identificare popolazioni cellulari di interesse dalla loro espressione di superficie dell’indicatore e misurare specificamente il contenuto lisosomiale o mitocondriale attraverso degli organelli specifici coloranti in queste cellule. Qui, dimostriamo la procedura dettagliata di analisi cytometric di flusso che valuta la massa lisosomiale o mitocondriale nelle sottopopolazioni principali splenico delle cellule T.

Protocol

La procedura di raccolta del tessuto del mouse qui descritta è stata approvata dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della National Yang-Ming University. 1. preparazione della sospensione del linfocita da organi linfoidi Eutanasia il mouse da un metodo approvato come l’inalazione di CO2 in un alloggiamento acrilico trasparente seguito da dislocazione cervicale per assicurare la morte.Nota: Mantenere il tasso di flusso di CO2 per uno spostame…

Representative Results

Identificazione dei sottoinsiemi principali delle cellule di T in milza e timo In breve, sospensioni di cellule singole da milza e timo sono state lisate di cellule rosse del sangue, incubate con 2.4G2 surnatante, seguite da colorante specifico organello e marcatore di superficie macchiando con gli anticorpi coniugati a fluorescenza (tabella 1). La progressione dello sviluppo dei timociti può e…

Discussion

Questo protocollo combina organello specifici coloranti e marcatore di superficie macchiatura per quantificare la quantità di mitocondri o lisosomi in popolazioni differenti delle cellule T. Questo metodo è stato sviluppato per superare le limitazioni dei requisiti di numero e omogeneità di cella per i metodi tradizionali, come la microscopia elettronica e l’analisi di immunoblot. È particolarmente utile nell’analisi di popolazioni di cellule rare ed esaminare contemporaneamente più tipi di cellule allo stesso tempo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan Ministero della scienza e tecnologia (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 a C.L. Hsu. C.W. Wei è un destinatario di eccellente tesi premio dell’Istituto di microbiologia e immunologia, National Yang-Ming University.

Materials

10 cm Graefe forceps (straight and serrated) Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) Dimeda
15 mL centrifuge tube Thermo Fisher Scientific 339650
5 mL syringe TERUMO 
6 cm Petri dish α-plus
70 µm nylon cell strainer SPL Lifesciences 93070
Ammonium chloride (NH4Cl)    Sigma A9434
Anti-mouse CD25 Biolegend 102007 Clone:PC61
Anti-mouse CD4 Biolegend 100453 Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44 Biolegend 103029 Clone:IM7
Anti-mouse CD62L Biolegend 104407 Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8 Biolegend 100713 Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ Biolegend 109233 Clone:H57-579
BD LSRFortessa BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Bio basic 6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) BD Biosciences 352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) ATCC HB-197 
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone ATD161145
Flowjo, LLC BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma H4034
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
LysoTracker Green DND26 Thermo Fisher Scientific L7526
MEM Non-essential amino acids (100X) Gibco 11140050
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3) J.T.baker 298-14-6
Propidium iodide solution Sigma 25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder) Gibco 31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070

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Cite This Article
Wei, C., Zhou, T., Dzhagalov, I. L., Hsu, C. Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells. J. Vis. Exp. (143), e58844, doi:10.3791/58844 (2019).

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