Bu çalışmada bir vitro modeli (arsenik etkisi hücresel geçiş gibi nasıl çevre kirletici maddeleri belirlemek için yara iyileşme sıfırdan testin) bir mekanizma olarak odaklanır. Bu içinde vitro tahlil değişiklikleri için in vivo deneyler önce hücresel göç hızlı ve erken belirtileri sağlar sonuçlar gösterilmektedir.
Yara iyileşmesi fizyolojik mekanizmaları anlama uzun yıllar devam eden araştırma odağı olmuştur. Bu araştırma doğrudan yaraları tedavi ve hastalar için azalan morbidite ve mortalite için kullanılan klinik standartlar değişimler dönüştürecektir. Yara iyileşmesi stratejik hücre ve doku etkileşimi ve işlev gerektiren karmaşık bir süreçtir. Yara iyileşmesi pek çok kritik düzeyde önemli işlevlerinden biri, bireysel ve kolektif hücresel geçiş değil. Yaralanma çeşitli hücreler kandan bağ ve epitel doku hızla çevreleyen kimyasal ve/veya fiziksel uyaranlara yoluyla yara bölgesine göç eder. Bu geçiş yanıt büyük ölçüde sonuçları ve başarı bir şifa yara dikte edebilirsiniz. Bu belirli hücresel işlev anlama sonuçları şifa geliştirilmiş yara açabilir translasyonel tıp için önemlidir. Burada, biz gibi yara iyileşmesi ve nasıl hücresel ortamındaki değişiklikleri önemli ölçüde bu işlem değiştirebilir ilgilidir hücresel geçiş daha iyi anlamak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu örnek çalışmada, dermal fibroblastlar fetal sığır serum (FBS) ile desteklenen medya doku kültürü şişeler kültürlerde monolayer olarak yetiştirilmiştir. Hücreleri aseptik doku kültürü tedavi 12-şey kalıplara aktarılır ve % 100 izdiham için büyüdü. İzdiham ulaşan üzerine monolayer hücrelerde dikey p200 damlalıklı ucu kullanarak çizik. Kültür FBS ile desteklenen medya seyreltilmiş arsenik bireysel wells çevre 0.1-10 M. görüntüler arasında değişen uygun doz her 4 saatte (s) hücresel geçiş gözlemlemek için (yara bir ters ışık mikroskobu kullanılarak bir 24 Saat süre içinde ele geçirildi eklendi kapanış). Görüntüleri tek tek görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz ve yüzde yara kapatma hesaplanmıştır. Arsenik yara iyileşmesi aşağı yavaşlatır sonuçlar gösterilmektedir. Bu teknik, yara iyileşmesi üzerinde kirletici etkilerinin için hızlı ve ucuz ilk ekran sağlar.
Yara iyileşmesi çeşitli hücre tipleri, sinyal molekülleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin1ilgili adımları çakışan karmaşık bir dizi oluşur. Birlikte, bu bileşenler konserinde yara çözünürlük veya onarım, sonuçta travma1derecesine bağlı olarak koruyucu bir fibrotik yara oluşumuna yol açan elde etmek için çalışır. Bireysel süreçleri ve fonksiyonlar yara yakalamak için bir deneyde şifa zordur; bireysel adım süreci şifa yara içinde tanımlanan ve ayrı ayrı test gerekir. Yara iyileşmesi birçok adımları arasında hücresel geçiş sürecinin iyileşme oranları2değerlendirirken kritik olarak kabul edilmiştir. Hücresel geçiş yara iyileşme tüm aşamalarında dikkat edilmesi ve böylece daha fazla hücre geçiş için değişiklik yara kapatma nasıl etkileyebilir anlayış gerektirir. Örneğin, hücresel geçiş kan pıhtılaşması ve trombosit toplama yara sitesi3ile hem erken ve geç faz iltihabı görülmektedir. Bu olaylar yoksun doku3yaralı alanları doldurmak için geçici bir tıkanma oluşturarak aşırı kan kaybını önlemek. Trombosit dolaşımda sentez ve kemotaktik faktör, birlikte hangi sinyal inflamatuar lökosit göç (beyaz kan hücreleri) için yaralı doku tamir4ile birlikte vazoaktif arabulucu salgılar. Yeniden epithelialization doku yaralanması saat içinde oluşur ve yara site üzerinden etkinlik ve daha fazla kirlenmesini önlemek için epitel keratinositler geçirilmesi veya yara site2yabancı parçacıklar işgali kapsayan içerir. Yaranın normal iyileşmesi birkaç işlevleri ile ilişkili birçok hücre göç sadece bu örnekler yakalamak.
Kazı-kazan tahlil açıklanan ve hücre göç ve5,6şifa yara içinde birçok rolleri daha iyi anlamak için kullanılır. Bu tahlil basit olarak kabul edilir, yüksek üretilen iş sağlar ve temsilcisi hücre göç veri toplamak için Dedektif sağlar. Geçiş deneyleri başarılı bir şekilde bazı bileşikler hücresel geçiş6oranı yavaşlatmak veya hızlandırmak olabilir gösterdi. Ayrıca, bu tahlil sonuçlar hedef tedaviler, konsantrasyonları ve genler vivo içinde deneme önce ilgi dozaj formüle için kullanılan translasyonel fizyolojik bilgi sağlar. Tahlil gerektiren temel hücre kültürü teknikleri ve malzemeleri, seçim ve görüntüleme teknolojisi zamana veya hareket tedavilere yanıt hareketi yakalamak için bir hücre satırı.
Tahlil kolayca manipüle veya araştırmacı gereksinimlerine uyacak şekilde özel olarak tasarlanmış. Ancak, önce deneme dikkate dört temel soru vardır. Ne genel veya belirli soru (lar) olduğundan/cevap vermeye investigator(s) misin? Bu araştırma odaklı çoğu hipotezler için geçerlidir; Ancak, birçok parametreleri doğru gerekiyordu ve tamamen cevap soru (lar) belirleyecek çünkü bu tahlil için kritik öyle. Ne hücre satırı veya satırları (birden fazla) hücresinde okudu olmak fizyolojik sistemini temsil için kullanılmalıdır? Kutanöz bir yara Örneğin, şifa çalışması, dermal fibroblast5,6,7, kök hücre8veya epidermal keratinosit9 normalde bulunan hücre popülasyonlarının temsil etmek için kabul edilebilir Cilt doku10bolluk içinde. Alternatif olarak, nötrofiller, makrofajlar veya diğer inflamatuar hücre hücre göç cilt doku10içinde yara iyileşmesi bir diğer bileşenleri temsil etmek için bu sistemde değerlendirilmiş. Ayrıca, değerlendirilen belirli hücre kültürünü tanıtan hangi reaktifler hücre metabolik aktivite tanıtmak için kullanılacak en uygun alanları tespit etmek için yardımcı olacaktır. Nasıl hücre göç izlenen/yansıma olacak mı? Hücre geçiş bir tabak ya da cep şişesi içinde gözlemlemek için kullanılan teknikler vardır. Örneğin, boyama veya fluorescently hücreleri etiketleme ve hücre izlemek için floresan veya confocal Imaging kullanarak hücresel vs hücresel olmayan yerleri ve hücresel hareketi11 açıkça tanımlamak için Dedektif sağlar güçlü bir kontrast sağlar . Bu çalışmada, açıklanan başka bir ortak teknik faz kontrast6,7ile ters ışık mikroskobu kullanmaktır. Hücre boyalar ve floresan bu alternatif ölümcül hücreleri görüntüleme önce düzeltmek zorunda kalmadan parça hücreleri yaşamak kullanıcı ve ayrıca bireysel wells zaman puan arasında yaralı monolayers hücre içeren aynı görüntüleri yakalamak için izin verir. Ne sonuç ölçer çözümlemesi için kullanılan? Görüntüleri kullanarak, çalışma, veri değişiklikleri hücresel geçiş oranları için anlaşılabilir oluşturulabilir toplandı. Laboratuarımıza ters ışık mikroskobunun yakalanan mikroskobik görüntüleri görüntü analiz yazılımı için yüklenir ve yüzde yaranın kapanması ve eğri (AUC) altındaki Toplam alan hesaplanır.
Biz özel kullanım dermal fibroblast geçiş bilinen çevre kirletici, arsenik huzurunda yapılan değişiklikler aydınlatmak için bu testin vurgular. Arsenik Yerkabuğu içinde bulunan doğal olarak meydana gelen bir madene var. Çeşitli yerlerde bu konumlar yaşayan bireyler için riski arsenik düzeyleri ile tespit edilmiştir. Sonuç olarak, yiyecek ve su kaynakları için arsenik maruz olur bireyler için olasılığını artırır arsenik kirlenme düzeyleri artmıştır gösterilmiştir. Çevre arsenik maruz kalma insan nüfusu yukarıda veya bile aşağıda mevcut ABD Çevre Koruma Ajansı (USEPA) Max geçen madde düzeyi (MCL) 10 app (10 µg/L)12, içinde uzun vadeli sağlık sonuçları için gösterilen 13. USEPA bu MCL ayarla ve sınırları içmek için güvenli olarak kabul rağmen bu sınırı aşmasına arsenik konsantrasyonu Su kaynaklarında dünya çapında nadir değildir. Güneybatı Amerika Birleşik Devletleri’nde çok sayıda toprak-su, kuyu suyu ve yaylar arsenik14düzeyde ile ilgili içeren için belgelenmiştir. Örneğin, Verde Valley, AZ, Montezuma iyi 210 µg/L arsenik15içerir. Yeraltı suyu Verde River, AZ çevresinde 16 µg/L arsenik ortalama 1.3 mg/L15,16ulaşan en yüksek değerlerle içerir. Özellikle, birçok Wells Verde nehir su döken arsenik konsantrasyonu 50 µg/L15,16uzun. Bu bilgiyle, çevre ilgili arsenik konsantrasyonu edildi14,15,16 MCL 10 µM (750 App) mevcut, yukarıda çalışmaya o Aralık MCL 0,1 µM (7,5 App), yönü aşağıdan seçerek , 17 , 18 , 19 , 20 .
Bu deneylerden toplanan bilgiler arsenik ile kontamine yara bir vivo içinde hücresel geçiş oranları için olası değişiklikler erken bir göstergesi olarak kullanılacaktır. Daha sonra yara iyileşmesi ve hücresel geçiş kolaylaştıran rollerini temel sinyal molekülleri seçilebilir ve geçerli tamamlandıktan sonra gelecek nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) dayalı gen ifade deneyler ayarlanabilir çalışmalar. Bu tahlil geçiş oranları huzurunda arsenik değiştirirseniz, hücresel geçişinde belirli bir gen düşman hedefi arsenik zararlı etkileri için hedef olabilir ve böylece bozulma mekanizması olabilir.
Bu testin uygulama hücresel geçiş yüksek üretilen iş ve zamanında bir değerlendirme sağlar ve doğrudan karmaşık fizyolojik sistemleri5,6,7‘ ye çevirmek. Bu nedenle, önerilen tezgah üstü model ayarlı ve6şifa yara çeşitli terapötik ajanlar ve çevresel toksinler etkilerini değerlendirmek için çalışmıştır. Mevcut çalışmada kullanılan arsenik konsantrasyonu çevre bilinen maruz kalma seviyeleri geniş edebiyat arama ile ilgili kabul edildi ve çeşitli veri retrospektif incelenmesi14,15, üsleri 16,17,18,19,20,21. Bu vitro sıfırdan tahlil kullanımı bu maruz kalma bir arsenik konsantrasyonu yüksek, ama çevre ilgili aralığı içinde gösterdi, gecikmiş yara kapatma (hücresel geçiş).
Bu tezgah üst model ayrıca yalıtmak ve daha fibroblast geçiş şifa sonuçları yara nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için bir tek hücre satırı (fibroblast) çalışma için istihdam edildi. Ayrıca, bu analizi ile engelleyebilir bir tek hücre satır karmaşık vivo içinde sistemleri ile diğer birçok hücre ve dokulara mevcut işlevleri çalışma zordur. Ayrıca, tahlil hangi aracılığıyla yara iyileşmesi bileşikler etkileyebilecek belirli hücresel mekanizmaları hedef için kullanılan yarı kantitatif yüzde yara kapatma verileri elde etmek için bir yol sağlar. Örneğin, sıfırdan assay olarak kullanılan hücre toplanan ve istenen bir reaktif saklanabilir ve gen ifadesinde kullanılan (mRNA sinyal) veya protein ifade deneyleri22. Bu bilgi ne sinyalleri veya proteinler büyük ölçüde değişik tedaviler (Yani, arsenik)22huzurunda hücresel geçiş değişikliklere katkı olabilir anlamak aradıkları araştırmacı için yararlı olabilir.
İnsan yenidoğan dermal fibroblastlar yara iyileşmesinde önemli rollerine dayanarak bu iş için seçildi. Ancak, bu karalama tahlil protokolü kullanarak çeşitli hücre tiplerinin uygulamaya konmuştur ve araştırma amaçlı bir dizi için. Örneğin, sıfırdan tahlil türleri çalışmak için göç inhibisyonu kemoterapi ilaçları23Onkoloji alanında içine kabul edilmiştir; iskelet kas hücre göç, yayılması ve Difüzyon24için; hücresel geçiş25bitki özleri etkisini incelemek için; ve anlamak için nasıl keratinosit geçiş ve nükleer silahların yayılmasına karşı şifa9yara katkıda bulunur. Ayrıca, Pinto ve ark. tarafından önceki bir kağıt uranyum (U) ve trombosit açısından zengin plazma (PRP) sıfırdan tahlil6kullanarak hDFn geçişi olarak etkileri değerlendirilir. Bu çalışmanın amacı için bu tahlil hücresel geçiş (U) yavaş düşünülen bir ajan gibi hücresel göç (PRP) kadar hızlandırmak için düşündüm bir ajan etkisini test olabilir ölçüde anlamak oldu. Olarak anılan çalışmalarında görülebilir ve araştırma diğer müfettişler, kazı-kazan testin uygulama tarafından çeşitli modeller26yılında kullanım için yüksek potansiyele sahiptir. Yöntemleri içinde sağlanan ayrıntı rağmen müfettişler ve deneyler farkı beklenmelidir. Örneğin, hücresel geçiş oranları büyük olasılıkla bağlı hücre kültürünü benzersiz hücre türleri için gerekli gerekli mikro ek olarak kullanımda olarak dalgalanma olacaktır. Birçok hücre verim ve canlılığı ve yardım için önemli gözlemler bu protokolü notlar olarak listelenir. Ancak, müfettişler en uygun büyüme koşulları için ve bu yöntemi takıma giren öğretim genel hücre kültür iş için kullanmak için üreticinin önerilerini izleyin önerilir.
Kazı-kazan tahlil hücresel hareketlilik çalışma için son derece çok yönlü olmasına rağmen; beklenmedik önyargıları ölçme teknikleri ortaya çıkabilir. Örneğin, ImageJ el ile hücre göç cephede izlemek için kullanırken, varyasyon doğruluk ve temsilcisi veri toplama sınırlayabilirsiniz kullanıcıları arasında var olabilir. Ayrıca geçiş cephede kör kullanıcı önyargı en aza indirmek için tedavi için okumanız gereken dikkat edilmelidir. Ayrıca, el ile geçiş cephede tanımlayan hesap hatası hücreleri ve görsel olarak yanıltıcı olabilir form odak yapışıklıklar için ulaşmak için yeteneklerini tarafından pseudopod oluşumu nedeniyle seyahat ortalama mesafe neden olabilir. Gibi bir şekilde, floresan “hücre izci” kullanımı hücre yüzeyine boya veya geçiş algılamak için nükleer proteinler istemeden hücreler zamanla hücresel geçiş ölçerken yanlışlıklar kaynaklanan giderebilir. Bu uygun olumlu ve/veya negatif kontrolleri tamamen eşek için deneme içinde kayıtlı önerilir hücre satırlarındaki tedavinin etkisi. Bu testin uygulama sınırları tanınması tamamlanması gerekir. Bu tahlil içinde vitro deneyler elde edilen hücresel geçiş sonuçlarını doğrudan vivo sonuçları. tercüme edecek garanti etmez Yara iyileştirici ve hücresel geçiş karmaşık canlı bir sistem içinde hücre tipleri ve moleküler sinyaller çok sayıda içerir; her biri şifa yanıt etkileme potansiyeline sahip.
Özet olarak, kazı-kazan tahlil hücresel geçiş yanıt ortamlar6,25değişen yüksek üretilen iş tarama sağlamak için bulundu. Biz özellikle başarıyla hücresel geçiş işleminin çeşitli çevre ilgili dozda arsenik maruz kalma sonucu olarak yapılan değişiklikleri algılamak için bu iletişim kuralı kullanıldığında. Bu veriler çalışma daha fazla ve bu tahlil ve nasıl bu yollar arsenik poz tarafından değiştirilmiş hücresel geçişinde mekanik yollar değerlendirmek için sıfırdan tahlil kullanmak için gerekçe hazırladık.
The authors have nothing to disclose.
Bu yayında bildirilen araştırma azınlık sağlık ve sağlık eşitsizliklerin Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası U54MD012388 altında Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Class II A/B3 Biological Safety Cabinet | Forma Scientific | 15201-816 | |
Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 55082 | |
Water Bath | Precision | Model 182 | |
Inverted Microscope | Leica | Q080318 | |
CPR Centrifuge | Beckman | 349702 | |
Analytical Scale | Ohaus | I093 1125062111P | |
Weighting paper | VWR | H351125781212A | |
Biohazard bags | Fisherbran | 01-830A | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 309739-31053 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10566-016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Automatic Pipettor | Drummond | 140685 | |
p200 Pipette | Gilson | ||
p20 Pipette | Gilson | ||
Denominator | Fisher Scientific | D59707 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | |
T75 tissue flask | Corning | 430725U | |
15 mL Conical Tube | Fisherbrand | 05-539-5 | |
50 mL Conical Tube | VWR | 21008-178 | |
5 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11D | |
10 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Tissue Marker | Securline | 92167 | |
Wipes | Kintech | 34155 | |
70% Ethanol | Fisher | 63-67-0 | |
Non-Filter Pipet Tips | Fisherbrand | 16160210 | |
Bleach | Great Value | 220-04 | |
96-well | Falcon | 353915 | |
Cryovial Rack | Nalgene | 5030-0505 | |
Hemacytometer | Gizmo Supply | B00SCOGY56 | |
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
Conical Tube Rack | n/a | n/a | |
12-well plate | Corning | 3598 | |
Waste Beaker | n/a | n/a | |
1 mL Pipette | Fisherbrand | 13-678-11B | |
Straight Edge Ruler | n/a | n/a | |
Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn) | lot: 1734, 2902 | 106-05n | |
Rstudio Statistical Software | ver: 3.5.1 | ||
Image J | NIH | ver: 1.8.0_112 |