Microglia, las células inmunes residentes del cerebro, responde rápidamente con cambios morfológicos a modificaciones de su entorno. Este protocolo describe cómo usar microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de procesos de microglial hacia serotonina o ATP en rebanadas de cerebro agudo de ratones.
Las células microgliales son residente células inmunes innatas del cerebro que exploración su entorno con sus largos procesos y constantemente, con disrupción de la homeostasis, experimentan rápidos cambios morfológicos. Por ejemplo, una lesión de láser induce en pocos minutos un crecimiento orientado de los procesos de microglial, también llamado “motilidad direccional”, hacia el sitio de la lesión. Un efecto similar puede obtenerse mediante la entrega localmente ATP o serotonina (5-hidroxitriptamina [5-HT]). En este artículo se describe un protocolo para inducir un crecimiento direccional de microglial procesos hacia una aplicación local de ATP o 5-HT en rebanadas de cerebro agudo de ratones jóvenes y adultos y a esta atracción con el tiempo la imagen por microscopía multifotón. Se propone un método simple de cuantificación con software de análisis de imágenes gratis y de código abierto. El tiempo limitado, disminuyendo con la edad, durante el cual las células permanecen en un estado fisiológico es un reto que todavía caracteriza a rebanadas de cerebro agudo. Este protocolo, por lo tanto, destacan algunas mejoras técnicas (cámara de medio interfaz aire-líquido, cámara con una doble la perfusión de la proyección de imagen) para optimizar la viabilidad de las células microgliales durante varias horas, especialmente en sectores de ratones adultos.
Las células microgliales son macrófagos residentes del cerebro y desempeñan un papel en ambas condiciones fisiológicas y patológicas1,2. Tienen una morfología muy ramificada y son constantemente ampliando y contrayendo sus procesos3,4. Este comportamiento de “análisis” se cree para ser relacionados y necesarios para el estudio de su entorno. La plasticidad morfológica de microglía se expresa de tres modos. En primer lugar, algunos compuestos rápidamente modulan la morfología microglial: la adición de ATP5,6 o NMDA5,7 en el medio que baña las rebanadas de cerebro agudo incrementa la complejidad de las ramificaciones de la microglía, mientras que la noradrenalina disminuye6. Estos efectos son directamente mediados por receptores de la microglía (para ATP y de la noradrenalina) o requieren una liberación de ATP de las neuronas (para NMDA). En segundo lugar, la velocidad de crecimiento y retracción de procesos microglial, llamado “vigilancia”, o la motilidad puede ser afectada por factores extracelulares8homeostasis interrupciones9,10y mutaciones9, 10,11. En tercer lugar, además de estos cambios isotrópicos de la morfología y motilidad, microglia tienen la capacidad de extender sus procesos direccionalmente hacia una pipeta entrega ATP3,5,12, 13 , 14, en la cultura, en rebanadas de cerebro agudo o en vivo, o entrega 5-HT en rebanadas de cerebro agudo15. Tal crecimiento orientado de los procesos de microglial, también llamado motilidad direccional, primero fue descrito como una respuesta a una lesión local laser3,4. Por lo tanto, fisiológico, puede ser relacionado con la respuesta a la lesión o necesaria para dirigir procesos de microglial hacia las sinapsis o las regiones del cerebro que requieren poda durante desarrollo15,16, o enfisiológicas 17 ,18,19 o situaciones patológicas9,18,19,20 en la edad adulta. Los tres tipos de cambios morfológicos se basan en diferentes mecanismos intracelulares11,13,20y un compuesto determinado no necesariamente modular todas ellas (por ejemplo, NMDA, que actúa indirectamente sobre microglia, tiene un efecto en la morfología pero no induce motilidad direccional5,7). Por lo tanto, cuando con el objetivo de caracterizar el efecto de un compuesto, una mutación o una patología en la microglia, es importante caracterizar los tres componentes de su plasticidad morfológica. Aquí, describimos un método para estudiar el crecimiento direccional de microglial procesos hacia una fuente local del compuesto, que es, aquí, ATP o 5-HT.
Hay varios modelos para estudiar la atracción de los procesos microglia: cultivos primarios en entorno 3D6,18,19, cerebral aguda rebanadas6,13,15y en vivo proyección de imagen3,13. El enfoque en vivo es lo mejor para preservar el estado fisiológico de la microglia. Sin embargo, la proyección de imagen intravital de regiones profundas requiere procedimientos quirúrgicos complejos y, por lo tanto, a menudo se limita a las capas corticales superficiales. El uso de cultivo primario de la microglia es la técnica más sencilla para probar un gran número de condiciones con un número limitado de animales. Sin embargo, es imposible obtener la misma morfología de la célula como en vivo, y las células pierden sus interacciones fisiológicas con neuronas y astrocitos. Rebanadas de cerebro agudo representan un compromiso entre estos dos enfoques. Este modelo permite a los investigadores a estudiar las estructuras del cerebro que de lo contrario son difíciles de llegar y a la imagen con alta resolución en vivo e investigar rebanadas de etapas neonatales, mientras que la microscopía transcraneal se realiza sobre todo en la edad adulta. Por último, permite observar en tiempo real los efectos de la aplicación local de la droga y a repetir experimentos utilizando un número limitado de animales. Sin embargo, un problema con las rebanadas de cerebro agudo es el poco tiempo (unas horas) durante el cual las células siguen vivas, en particular para rebanadas de ratones más de dos semanas y el potencial cambio de morfología de la microglia por vez21,22 .
Aquí, describimos un protocolo para preparar rebanadas de cerebro agudo de jóvenes y adultos Cx3cr1GFP / + ratones hasta dos meses de edad, con la preservación de la morfología de la microglia y motilidad durante varias horas. A continuación, describimos cómo usar estas láminas para estudiar la atracción de los procesos de microglial hacia compuestos como ATP o 5-HT.
Al mantener, a diferencia de en disociado o organotypic de la rebanada cultura, una integridad estructural con los ajustes de red limitada, rebanadas de cerebro agudo permiten a los investigadores para el estudio de microglia en su entorno fisiológico. Sin embargo, una de las limitaciones más importantes es el hecho de que el procedimiento de corte crea lesiones que rápidamente pueden poner en peligro la viabilidad de las neuronas, especialmente en el cerebro adulto. Como microglia son particularmente reactivas a dañ…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la célula y tejido de imágenes de la Institut du Fer à Moulin, donde se han realizado todos los análisis y adquisición de la imagen. Este trabajo ha sido apoyado en parte por el Centre National de la Recherche Scientifique, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, las Ciencias de la Universidad de Sorbonne y por donaciones de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Universidad ( Programa Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, el Ministerio francés de la investigación (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 y el Avenir Investissements programa “Bio-Psy empresa Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) y una investigación en colaboración en el programa de neurociencia computacional, Agencia Nacional de la ciencia francés Fundación Nacional para la investigación (número: 1515686). Todos los autores están afiliados a la investigación de los grupos que son miembros de la escuela de París de Neurociencia (PEV) y de la empresa Labex Bio-Psy. F.E. es estudiante de doctorado asociado a Sorbonne Université, Colegio Doctoral, F-75005 París, Francia y está financiado por la empresa Labex Bio-Psy. V.M. es becario posdoctoral financiado por la investigación colaborativa en el programa de neurociencia computacional, Agencia Nacional de la ciencia francés Fundación Nacional para la investigación (número: 1515686). Los autores agradecen a Marta Kolodziejczak que participaron en la iniciación del proyecto.
for pipettes preparation | |||
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
for solutions | |||
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
for slice preparation | |||
2x 200 mL crystalizing dishes | |||
80 mL Pyrex beaker | |||
Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
Ice | |||
Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
scalpel blade | |||
Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
for slice imaging | |||
× 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
for slice stimulation | |||
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
for image analysis | |||
Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mice | |||
CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |