שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות
Summary
אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.
Abstract
ישנם מגוון רחב של אסטרטגיות פתוגנים חיידקיים להעסיק כדי לשרוד להתרבות פעם אחת בתוך התא האיקריוטים. מה שנקרא ‘cytosolic’ פתוגנים (ליסטריה, שיגלה flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisו ריקטסיה spp.) לקבל גישה ציטוזול תא נגוע על-ידי enzymatically ופיזית משפילים קרום vacuolar הראשי. פעם אחת ציטוזול, פתוגנים אלה הן להתרבות כמו גם ליצור כוחות מספיקים מכני לחדור קרום פלזמה של התא המארח כדי להדביק תאים חדשים. . הנה, אנחנו מראים כיצד מסוף שלב של מחזור הסלולר זיהום של ל’ monocytogenes (Lm) ניתן לכמת על ידי המושבה יוצרי יחידת מבחני והן cytometry זרימה, לתת דוגמאות איך שני השפעת גורמים הפתוגן, המארח-בקידוד זה תהליך. אנו גם מראים התכתבות קרוב של Lm הדינמיקה זיהום של תאים בתרבית נגוע במבחנה, אלה בתאי הכבד נגזר עכברים נגועים ויוו. אלה מבחני מבוססי פונקציה פשוטה יחסית, ניתן בקלות לשנות-מבוססות-גילוי מסכי תפוקה גבוהה עבור מאפננים של תפקוד התאים האיקריוטים.
Introduction
זיהום מבוססי מודלים ניסיוניים הם מאתגר מיסודו בשל תלותם התנאים מדינת המוצא של המארח הפתוגן, את האסטרטגיות זיהום שונים של הפתוגן, ואת הקושי של ייחוס הפתוגן, המארח-מונחי תהליכים בהתבסס על תוצאות. החיידק ליסטריה (Lm) הפך פתוגן אידיאלי כדי לחקור את המארח ההגנה תגובות בגלל שלה גנטי, מיקרוביולוגי ללקוחות שלנו את האסטרטגיה מהיר ולא תהליכית זיהום הסלולר שלה, צלולים יחסית קשר בין פנוטיפים זיהום סלולרי-אורגניזם-ורמת שלה. זיהום הסלולר של Lm ממשיך דרך ארבעה שלבים ברורים1: (i) הפלישה הסלולר אשר מסכם עם Lm סגירות בתוך חלולית; (ii) Lm-בבימויו של התפרקות של קרום חלולית שחרורו של Lm לתוך ציטוזול; (iii) שכפול intracytosolic; חדירה פיזית (iv) של קרום פלזמה כי התוצאות גם זיהום של תאים סמוכים ישירות (כמו למשל גיליון אפיתל) או, בכל תאי בידוד, שחרורו של Lm לתוך חצרו חוץ-תאית. כל אחד משלבים אלה מקודמים על ידי ספציפי Lm-מקודד גורמים (המכונה ‘הגורמים התקפה אלימה’), נמחק, לגרום למומים זיהום במודלים הסלולר והן בבעלי חיים. אסטרטגיה זו זיהום כללי התפתח באופן עצמאי על-ידי מספר של פתוגנים ‘cytosolic’ כביכול2.
המושבה יוצרי מבחני יחידה (CFU) מועסקים באופן נרחב כדי להעריך את שניהם במבחנה (קרי, סלולר) כמו גם ויוו (קרי, אורגניזם) תוצאות הזיהום. בנוסף את רגישותם גבוהה, במיוחד עבור זיהומים ויוו, מבחני CFU מספקים readout ברורה וחד משמעית של פתוגן פלישה והתפשטות תאיים הישרדות /. CFU מבחני היו בשימוש נרחב כדי לנתח גורמים תא באימות Lm ומארח, שמשפיעים על זיהום. מחקרים קודמים אלה להיות לנתח הפלישה הסלולר ושכפול intracytosolic אינפורמטיבי, CFU מבחני. לא, לפי מיטב ידיעתנו, השתמשו כדי לעקוב אחר השלב הרביעי של תהליך זיהום Lm : הבריחה הסלולר. כאן, אנו מתארים פשוטה יחסית ניתן לנטר אמצעי לבריחה איך הסלולר (ןלהל ‘הופעתה’) על ידי CFU assay (כמו גם על ידי cytometry זרימה), הצג דוגמאות איך שני גורמים הפתוגן, המארח-מקודד לווסת את השלב הזה של Lm מחזור זיהום. הניתוח של השלב מסוף של מחזור הסלולר של זיהום Lm עלולה להפוך את זה ניתן לזהות הפתוגן נוספים, גורמים ספציפיים זיהום תא מארח ופעילויות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל תוכנית תהליכית וברכבות זיהום הסלולר שלה, Lm הוא פתוגן אידיאלי כדי לחקור את פעילות הסלולר להשפיע זיהום. זוהו מספר גורמים המארח, המשפיעות באופן חיובי או שלילי Lm זיהום הסלולר11,12,13,14. לארח שתיים כאלה גורמים מאופ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
