Summary

Immunohistopathologic исследование фолиевая кислота рецепторов бета макрофагов и сосудистой иммунной микроокружения в гигантоклеточная артериальный профиля

Published: February 08, 2019
doi:

Summary

Протокол иллюстрирует использование гистопатологические осмотра и иммуногистохимии профиль макрофагов бета рецепторов фолиевой кислоты и ее отношения с общей иммунных клеток проникнуть в биопсии височной артерии в гигантоклеточная артериальный.

Abstract

Гигантоклеточная артериит (ГКА) является хронической болезнью, связанный иммунной опосредованного артерий среднего и большого размера, затрагивает пожилых людей. GCA манифесты с артритом и окклюзионной симптомы головной боли, инсульта или потери зрения. Макрофаги и лимфоциты Т-хелперами проникнуть сосудистой стенки и производят про воспалительной реакции, которые ведут к судну ущерб и ишемии. На сегодняшний день, есть нет ГЦА биомаркеров, который может контролировать болезнь деятельность и руководство лечебных ответ.

Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosylphosphatidylinositol белок, который является якорь на клеточные мембраны и обычно выражается в линии миеломоноцитная и в большинстве клеток миелоидной лейкемии как опухоли и ревматоидные синовиальной макрофагов, где его выражение коррелирует с тяжести заболевания. FRB возможность привязать фолиевой кислоты соединений, фолиевой кислоты конъюгатов и antifolate наркотиков сделала его druggable цель в рак и воспалительные болезни исследований. В настоящем докладе описываются гистопатологические и иммуногистохимических методов, используемых для оценки выражения и распределение FRB по отношению к GCAimmunopathology.

Формалин исправлена и парафин врезанных височной артерии биопсий ГКА и нормального управления окрашивали гематоксилином и эозином пересмотреть Гистология ткани и определить патогномоничных функции. Иммуногистохимия была использована для выявления FRB, CD68 и CD3 выражение. Микроскопический анализ проводился для количественного определения количество положительно окрашенных клеток на 10 выбранных секций высокой мощности поля и их местоположения в стенке артерий.

Воспаление Lymphohistiocytic (ЛГ) в сопровождении гиперплазия интимы и нарушается упругой пластинки был замечен в ЗКО с ничего не найдено в элементах управления. LH инфильтрат состоит из примерно 60% лимфоцитов и 40% макрофагов. FRB выражение ограничивался макрофагов, состоящий из 31% всего населения CD68 + макрофагов и локализованные для средств массовой информации и адвентиции. Не FRB был замечен в элементах управления.

Этот протокол продемонстрировал шаблон различных численных и пространственной FRB макрофага по отношению к сосудистой иммунной микроокружения в ЗКО.

Introduction

Гигантоклеточная артериит (ВКА) является воспалительным заболеванием средне крупных артерий, ориентация аорты и ее ветвей и затрагивает пожилых людей. Она представляет с умеренной до тяжелой ишемических осложнений, таких как головные боли, боли в челюсти, потеря зрения, инсульта и тканей гангрены. Диагноз подтверждается высоким воспалительные маркеры как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и собственный гистопатологические картины на височной артерии биопсии (вкладка)1. ГКА является наиболее распространенным взрослых васкулит, и доступность височной артерии, полученные для диагностики представляет преимущество над другими специализирующемуся, таким образом позволяя один для изучения его патогенез более легко. Типичные результаты на закладке включают инфильтрата гистиоциты/макрофагов и Т-лимфоцитов, нашли на всех уровнях сосудистой интимы туника, СМИ и адвентиции с параллельной разрушения упругой пластинки, которая обычно отделяет эти 2отсеках. Текущий доказательства свидетельствуют, что ВКА включает неизвестный антиген, который активирует дендритные клетки в адвентиции сосудов, следуют найма помощника клетки T (Th), специально Th1 и Th17 подтипы, которые выделяют интерлейкина-17 и Интерферон гамма (МГС) соответственно. ИФГ затем новобранцев и активирует макрофаги производить цитокинов и протеаз. К ним относятся провоспалительных цитокинов; включая Ил-12, которая взаимно активирует клетки Th1, обеспечивая тем самым положительной обратной связью; фактор некроза опухоли и интерлейкина-6, вызывающие артрит и металлопротеаз и лихорадки, которые повреждают упругой пластинки. Глюкокортикоидов (GC), которые являются стандартной терапии хронической, частично управлять цитокина пути ослабления Th17/Ил-17, но не Th1/IFG руку иммунный ответ3,4. К сожалению прекращение GC приводит к рецидиву болезни. В качестве альтернативного механизма метотрексат был многоцелевых ГЦА лечения, но желаемого клинические конечные точки не были достигнуты последовательно, хотя более чувствительных биомаркеров не были использованы для терапевтического мониторинга5,6 . В 2017 году интерлейкин 6 окон, tocilizumab, был одобрен для лечения вка, как доказано эффективно болезнями и стероидных щадящие эффекты7,8.

На сегодняшний день, есть нет хороших biomarkers для ЗКО. В результате трудно контролировать активность заболевания и титровать дозы доступных препаратов, чтобы избежать неблагоприятных последствий и уменьшить бремя расходов для общества. Таким образом важно, чтобы искать кандидата биомаркеров, что коррелирует с активностью болезни, обеспечивают новые идеи по патогенезу и помощи в терапевтических решений.

Dysregulation активация макрофагов является решающим фактором в патогенезе ЗКО. Таким образом могут быть эффективным средством лечения вка, избирательного отношения к Активированные макрофаги. Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosyl фосфатидилинозитол гликопротеин, которая зиждется на клеточной мембране в нормальной миеломоноцитная клеток, клеток миелоидной лейкемии и активация макрофагов. Его лиганда, фолиевая кислота, является одним из важнейших витаминов в сокращенной форме, которая позволяет клеточной ДНК синтеза, метилирование и ремонт9. FRB выражение индуцируется в аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза. Его выражение ограничен поверхности моноциты или про воспалительных M1 макрофагов в ревматоидный артрит, или противовоспалительные м2 макрофагов в твердые органов и миелоидных злокачественных10,11,12 , 13. в дополнение к своей потенциальной роли в качестве биомаркера активированных макрофагов, FRB можно включить селективного наркотиков транспорта через многоступенчатый процесс, который начинается с привязкой рецепторов фолиевой кислоты, антифолаты или фолиевой кислоты конъюгированных наркотиков в ячейке поверхности, следуют интернализации, выпуска и окончательной доставки желаемого наркотиков внутренних ячейки машин12,14,15,16. В отличие от FRB выражена в раковых клеток и активации макрофагов, FRB, выраженные в нормальные гемопоэтические клетки способны связывать фолатов, обеспечивая тем самым, что FRB/фолиевой кислоты опосредованной лекарств ограничен FRB-положительных воспалительных или раковые клетки.

В нашем предыдущем исследовании мы показали в первый раз, что FRB выражается в ЗКО макрофагов и его выражение коррелирует с CD68 + и эндотелина рецептора бета макрофаги, которые способствуют ГЦА патогенеза17. В настоящем докладе мы описываем гистопатологические и Иммуногистохимические методы используются для оценки FRB макрофагов и анализируется общая лимфоцитов и макрофагов рассчитывает получить представление о FRB позиции в ЗКО сосудистой ландшафт.

Protocol

Все методы, описанные были утверждены Пенн государства институциональных Наблюдательный Совет. 1. гистопатологические подготовка и обработка после получения биопсии височной артерии Примечание: Биопсии височной артерии (вкладка) проводится под …

Representative Results

Гистопатологические выводы H & E пятна в нормальные образцы показали нормальная анатомия артерий с эндотелиальных клеток интимы туника, гладких мышечных клеток в СМИ туника, и разнородные коллагеновой матрицы, которые включаю…

Discussion

ГКА является наиболее распространенным васкулит у взрослых, и его патологического hallmark является примером мощное сочетание вспомогательные Т-лимфоцитов и активации макрофагов, которые также могут быть найдены в других гранулематозный заболевания или специализирующемуся как саркоид?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа стала возможной благодаря поддержке д-р Дуглас лестницы, Марианна Klinger, Энн Бенко, Отдел ревматологии/Департамента медицины и молекулярной и гистопатологические Core лаборатории, Пенн государственного университета колледж медицины, Херши PA.

Materials

Microtome Reichert-Jung
plain and frosted microscope slides and cover slips Fisher Scientific 
Vertical rack Fisher Scientific 
Light microscope Olympus BX60  microscope
Xylene
Acetone in distilled water concentrations 100%, 90%, 70%
Tris-buffered saline solution (TBS)  Dako Wash BufferS3006
3% hydrogen peroxide in TBS
Diaminobenzidine (DAB) Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  Mounting Medium Fisher Scientific  SP-15-100
Harleco Gill's III Hematoxylin Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution Fisher Scientific  23-749-977
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0)
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta  Manohar Ratnam optimized at 1:800
Monoclonal mouse anti-human CD68 Dako  M071801 optimized at 1:200
Polyclonal rabbit anti-CD3 Agilent Dako A0452 optimized at 1:100
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody Dako
Placental tissue  for FRB positive control

References

  1. Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
  2. Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
  3. Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
  4. Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
  5. Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
  6. Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
  7. Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
  8. Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
  9. Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
  10. Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
  11. Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
  12. Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
  13. Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
  14. Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
  15. vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
  16. Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
  17. Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
  18. Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
  19. Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
  20. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
  21. Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
  22. Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
  23. Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
  24. Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
  25. Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
  26. Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).

Play Video

Cite This Article
Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Kidacki, M., Ratnam, M., Olsen, N. J. An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis. J. Vis. Exp. (144), e58713, doi:10.3791/58713 (2019).

View Video