Hier presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de verwerking van codering (mRNA) en niet-coderende (ncRNA) globine verminderd RNA-seq bibliotheken uit een monster van één volbloed.
De komst van innovatieve en steeds meer krachtige volgende generatie sequencing technieken heeft nieuwe wegen geopend in de mogelijkheid te onderzoeken van de onderliggende genexpressie gerelateerde biologische processen van belang. Deze innovaties kunnen niet alleen onderzoekers te observeren-expressie aan vanaf het mRNA-sequenties die voor de genen die cellulaire functie effect code, maar ook de niet-coderende (ncRNA) molecules van RNA die onvertaald, maar toch blijven hebben regelgevende taken. Hoewel onderzoekers de mogelijkheid hebben om zowel ncRNA als mRNA uitdrukking te observeren, is het gebruikelijk dat een studie te richten op de ene of de andere geweest. Als echter studies zijn zowel ncRNA als mRNA uitdrukking kochten, vele malen ze gebruiken afzonderlijke monsters te onderzoeken niet-coderende RNAs vanwege het verschil in bibliotheek preparaten of codering. Dit kan leiden tot de noodzaak van meer monsters die tijd, verbruiksartikelen en dieren stress kan verhogen. Bovendien kan het onderzoekers om te beslissen voor te bereiden op monsters slechts één analyse, meestal de mRNA, beperking van het aantal biologische vragen die kunnen worden onderzocht. Echter omspannen ncRNAs meerdere klassen met regelgevende functies die effect mRNA uitdrukking. Omdat ncRNA zijn belangrijk voor fundamentele biologische processen en wanorde van deze processen in tijdens de infectie, kunnen ze daarom aantrekkelijk dedoelenvoorde therapeutics doen. Dit manuscript toont een gewijzigd protocol voor de generatie mRNA en niet-coderende RNA expressie bibliotheken, met inbegrip van de virale RNA, van een enkel bloedmonster geheel. Optimalisatie van dit protocol, verbeterd RNA zuiverheid, verhoogd afbinding voor herstel van gemethyleerd RNAs en maat keuze, zodat de vangst van de meer RNA soorten weggelaten.
Volgende generatie sequencing (NGS) heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de veranderingen die zich op het genomisch niveau van biologische organismen voordoen. Bereiding van de monsters voor NGS methoden kan gevarieerd worden afhankelijk van het organisme, weefseltype, en wat nog belangrijker is het vragen de onderzoekers graag adres. Vele studies hebben aan NGS gedraaid als een middel van het bestuderen van de verschillen in genuitdrukking tussen staten zoals gezonde en zieke personen1,,2,,3,4. De sequencing nemen plaats op basis van de hele genoom en laat een onderzoeker te vangen de meeste, zoniet alle, genomische informatie voor een bepaalde genetische marker tegelijkertijd wijs.
De meest voorkomende markeringen van meningsuiting waargenomen zijn de messenger RNAs (mRNAs). De meest gebruikte procedures voor prepping bibliotheken voor RNA-seq zijn geoptimaliseerd voor het herstel van mRNA moleculen door middel van een reeks van zuivering, breukpatroon en ligations5,6. Echter afhankelijk het besluit over de wijze waarop een protocol worden uitgevoerd sterk van het type van de steekproef en de vragen over het genoemde monster. In de meeste gevallen wordt de totale RNA geëxtraheerd; echter niet alle RNA-moleculen zijn van belang en in gevallen zoals mRNA expressie studies al te overvloedige RNA-soorten, zoals ribosomaal RNAs (rRNA) moet worden verwijderd om het aantal detecteerbare afschriften die is gekoppeld aan de mRNAs verhogen. De meest populaire en meest gebruikte methode voor het verwijderen van de overvloedige rRNA moleculen is de vermindering van de polyadenylated RNA afschriften polyA uitputting7hierna. Deze aanpak werkt goed voor de analyse van mRNA uitdrukking zoals doet geen afbreuk aan de transcripten van mRNA. Echter in studies die geïnteresseerd zijn in niet-coderende of virale RNAs polyA uitputting verwijdert u ook deze moleculen.
Veel studies verkiezen te concentreren op de RNA reeks bibliotheek voorbereiding om te onderzoeken of mRNA uitdrukking (coderen) of een bepaalde categorie van kleine of grote niet-coderende RNA. Hoewel er andere procedures8 als de onze die het mogelijk voor de bereiding van de monsters van de dual maken, bereiden veel studies bibliotheken van afzonderlijke monsters voor afzonderlijke studies beschikbaar. Voor een studie als de onze, zou dit normaal gesproken meerdere bloedmonsters stijgende tijd, verbruiksartikelen, en dieren stress vereisen. Het doel van deze studie was om het gebruik van bloed van dieren te identificeren en kwantificeren van de verschillende klassen van beide mRNA te kunnen en niet-coderende RNA uitgesproken tussen gezonde en hoogpathogene varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus (HP-PRRSV) uitgedaagd varkens9,10 ondanks het feit dat slechts een enkele volbloed steekproef (2,5 mL) van elk varken. Om dit te doen, die we nodig hadden om de typische extractie en bibliotheek creatie protocollen voor het genereren van de juiste gegevens te voorzien van analyse van mRNA zowel niet-coderende RNA (ncRNA) expressie11 van één sample te optimaliseren.
Dit leidde tot een behoefte aan een protocol dat is toegestaan voor mRNA en analyse van niet-coderende RNA omdat de beschikbare standaard kits en de methoden voor RNA-extractie en bibliotheek creëren bestemd waren voornamelijk voor mRNA en gebruik een poly-A uitputting stap12. Deze stap zou hebben gemaakt het onmogelijk om te herstellen van niet-coderende RNA of virale afschriften uit het monster. Dus, een geoptimaliseerde methode nodig was dat toegestaan voor totale RNA extractie zonder monster polyA uitputting. De methode voorgesteld in dit manuscript is geoptimaliseerd voor het gebruik van volbloed als een monster type toestaan en sequencing bibliotheken te bouwen voor zowel mRNA en ncRNAs voor kleine en grote maten. De methode is geoptimaliseerd om te voorzien in de analyse van alle aantoonbaar niet-coderende RNAs evenals virale RNAs voor later onderzoek13behouden. In alle zorgt ons geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding protocol voor het onderzoek van meerdere RNA-moleculen uit een monster van één volbloed.
Het algehele doel achter het gebruik van deze methode was een proces dat is toegestaan voor de collectie van zowel niet-coderende RNA en mRNA uit één monster van volbloed te ontwikkelen. Daardoor kunnen we in onze studie afkomstig uit een monster9mRNA, ncRNA, en virale RNA voor elk dier hebben. Dit, uiteindelijk zorgt voor meer wetenschappelijke ontdekking zonder dierlijke meerkosten en geeft een completer beeld van de expressie van elk individuele monster. De beschreven methode geschikt is voor het onderzoek van de regelgevers van genexpressie, alsook het zodat voor voltooiing van oereenstemming studies vergelijken beide mRNA en niet-coderende RNA expressie met behulp van een enkel geheel bloedmonster. Onze studie gebruikt dit protocol te onderzoeken van de wijzigingen in genexpressie en mogelijk epigenetische regelgevers in viraal geïnfecteerde 9 – weken oude mannelijke commerciële varkens.
De eerste kritieke stap in het protocol dat het geoptimaliseerd maakte opgenomen de toegevoegde globine uitputting stappen, waardoor het mogelijk is om kwaliteit leest van volbloed monsters. Een van de grootste beperkingen op het gebruik van volbloed in sequencing studies zijn het hoge aantal leest in de steekproef die zal toewijzen aan globine moleculen en verminderen de leest die naar andere moleculen van belang18 verwijzen kunnen. Daarom, in het optimaliseren van het protocol voor onze steekpro…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd vooral ondersteund door de door USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, en gedeeltelijk door NIFA AFRI 2015-67015-23216 van de USDA. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een afspraak aan de landbouw onderzoek onderzoek deelname serviceprogramma beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs (ORISE) door een interdepartementale overeenkomst tussen de ons Department of Energy ( DOE) en het Amerikaanse ministerie van landbouw. ORISE wordt beheerd door Oak Ridge Associated Universities DOE arbeidsovereenkomst niet. DE-AC05-06OR2310.
We zouden graag bedanken Dr Kay Faaberg voor de besmettelijke klonen van HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier voor haar hulp bij dieren die betrokken zijn bij het experiment, en Sue Ohlendorf voor secretariële assistentie ter voorbereiding van het manuscript.
PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
10X Oligo Hybridization Buffer | |||
-Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
-KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
10X RNase H Buffer | |||
-Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
-DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
-MgCl2 | Promega | A351B | |
-Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
Microcentrifuge | Any supplier | ||
2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |