항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.
Multidrug 저항 (MDR) 병원 체의 속도 상승, 계속 새로운 제의 개발 능가 MDR 박테리아의 치료에 새로운 접근 필요 되 고 점점 더 있다. 이러한 방법 중 하나는 조합 치료에 두 개 이상의 항생제 치료에 대 한 감염을 함께 되는 마약 중 어느 하나 또는 모두 효과가 있을 수 있습니다 하지 혼자. 때 조합에 두 약물 발휘는 큰 첨가제 효과 보다 시너지 간주 됩니다. 시너지 활동의 체 외 조사 약물 조합 가능한 효능 평가에 중요 한 첫 단계 이다. 두 가지 주요 체 외 시너지 테스트 방법 개발 되었습니다: 바둑판 배열 및 시간 죽 일 연구. 이 문서에서 우리는 자동된 바둑판 배열 방법을 제시는 효율성과이 기술 표준 수동 시간 죽이기 시너지 방법의 정확도 높이기 위해 잉크젯 인쇄 기술의 사용. 자동화 된 바둑판 배열 수동 시간 죽 일 연구 시너지 활동 및 살인에 추가, 무료 데이터를 제공 하는 동안 높은 처리량 검사 분석 결과 검색할 수 있습니다.
바둑판 배열 박테리아 다른 농도 조합에 항생제와 인 큐베이 팅 및 숙박 부 화 후 성장 억제에 대 한 평가 표준 최소 억제 농도 (MIC) 테스트의 수정입니다. 바둑판 배열의 수동 성능 힘들고 오류가 일련을의 계산 및 희석이 필요합니다. 자동화 된 방법에서 제시 여기, 계산의 필요한 항생제 재고 솔루션 볼륨 잉크젯 프린터 기술을 통해 자동 분배. 시간 죽이기 시너지 분석 결과에서 박테리아 함께 개별적으로, 관심, 항생제와 함께 알을 품는 그리고 양적 문화에 대 한 24 시간에 걸쳐 샘플링 간격. 결과 조합 인지 시너지 및 살 균, 인지를 확인 하 고 시간이 지남에 저해 및 박테리아의 살해에 데이터를 제공 수 있습니다.
Multidrug 저항 (MDR) 세균성 병원 체, 특히 MDR 그람 음성 박테리아 carbapenem 저항 Enterobacteriaceae (CRE) 등의 확산은 성공적인 조직과 치료 에 대 한 점점 더 제한 된 옵션 임상을 두고 있다 1, 소설 항균 약 발견2,3의 느린 속도 의해 악화 문제. 이러한 박테리아는 하나 또는 둘 다에 저항 하는 경우에 기존 항생제 MDR 박테리아의 치료에 사용 하기 위해 인양의 가능성을 제공 하는 조합에 사용 되는 두 약물 첨가제 보다 더 큰 효과 발휘 하는 항균 시너지 효과 항생제 개별적으로. 생체 외에서 시너지 효과 함께 사용 하는 경우, 테스트의 두 가지 보완적인 방법을 제공 하는이 문서에 설명 된 기술을 효율적으로 화면 항균 조합의 시너지 활동 (자동화의 증거에 대 한 관심을 조사 허용 바둑판 배열 방법) 그리고 더 억제 및 심사 단계 (수동 시간 죽 일 방법)에서 확인 된 유망한 조합에 의해 증명 하는 살인의 활동을 평가.
생체 외에서 시너지 테스트의 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 바둑판 배열 분석 결과, 두 개의 서로 다른 항생제는 세균에 대 한의 금지 활동 분리 최소 억제 농도 (MIC) 테스트의 수정 테스트 이상의 농도 조합4,5의 범위. 두 약물 첨가제 활동 함께 사용 하면 보다 큰 발휘, 결합 시너지6간주 됩니다. 그러나, 수동으로 바둑판 배열 설정 계산 diluting 및 pipetting 단계 및 힘들고 인간의 오류에 취약의 일련을 포함 한다. 이러한 제약 조건 테스트 항생제 조합과 세균 분리의 작은 숫자의 회 고 평가를 주로 하는 시너지 효과의 사용을 제한의 효과 없 그리고 결과 항상 연구7, 간에 일관 되지 않은 8,9,,1011. 또한, 시너지 테스트의 복잡도 기여 임상 미생물학 실험실에 그것의 불가능 하 조합 치료12, 의 임상 연구에서 생체 외에서 시너지 테스트 데이터의 가상 부재 13.
효율성과 바둑판 배열 방법의 처리량을 증가 하기 위하여 우리가 만든 자동된 마이크 테스팅 기술 이전 기술을 사용 하 여 잉크젯 인쇄를 정확 하 게 우리의 실험실에서 개발 사용 하 고 일관 되 게 작은 볼륨을 분배 결정 플레이트14에 우물으로 항생제 재고 솔루션. 플랫폼 복잡 한 계산 및 여러 pipetting 단계에 대 한 필요성을 obviates. 관련된 소프트웨어 계산 하 고 적절 한 양의 사용자는 단순히 원하는 농도 범위를 입력 하는 경우 2 차원 바둑판 배열을 만드는 항생제와 항생제의 재고 솔루션 농도 dispenses. 우리 처음 CRE 격리15 의 컬렉션에 대해이 메서드를 테스트 하 고 이후 colistin 포함 된 조합 colistin 저항 격리16에 대 한 활동에 대 한 테스트에 집중 했다. Colistin은 일반적으로 그람 음성 병원 균17,18, MDR과 colistin 저항의 치료에 사용 하기 위해 예약 하는 마지막 수단의 마약 렌더링 이미 MDR 박테리아 거의 팬 저항19, 이상적 이다 그들은 구분 하지 않습니다 개별적으로 약물을 사용 하 여 새로운 치료 전략의 개발을 위한 후보자. 우리 colistin과 단백질 합성 억제제 항생제 minocycline의 조합 시너지, 심지어에 대 한 내성을 했다이 약의 각각 개별적으로, 아마도 colistin 미치는 subinhibitory 때문에 긴장의 매우 높은 비율을 했다 발견 심지어 colistin 내성 박테리아에 permeabilizing 효력입니다. 이 문서에 예제로 사용 하 여이 조합을 선택 했습니다. 메모의 시너지 테스트 또한 사용할 수 있습니다 개별적으로 효과적인 둘 다는 두 약물의 향상 된 효능에 대 한 평가.
자동화 된 바둑판 배열 방법 신속 하 고 높은 처리량 시너지 테스트 수 있습니다. 그러나, 바둑판 배열 방법에 한계는 수 있습니다. 으로 수정된 마이크 분석 결과 데이터의 세균 성장 억제에만 그리고 살인에 제공 하지 않는 데이터 항생제 효과에 시간이 지남에. 대조적으로, 시간 죽이기 시너지 분석 실험의 수동 성과 더 많은 노동 집약 하지만 24 시간 코스20,21이상 억제와 살인에 정보를 제공 합니다. 우리는 사용 하는 시간-죽 여 분석 우리의 바둑판 배열 결과 확인 하 고 식별 시너지 조합 했다 살 균 여부 결정 하에 격리 된 것의 더 작은 수에.
두 바둑판 배열 및 시간-죽 여 시너지 방법 약물 조합의 활동에 귀중 한 정보를 제공 되며 내성 세균 병원 균에 대 한 잠재적인 새로운 치료 옵션을 평가에 특히 유용 합니다. 메서드는 또한 고유의 제한 사항이 있습니다. 표준 microbroth 희석 마이크 방법 1 2 배 희석22, 두 약물은 바둑판 배열에 함께 테스트 때 증가 알려진된 예상된 오류 범위를 하고있다. 시너지, 시너지 조합 약 1 / 4 그들의 각각 마이크6에 함께 활성 경우에 고려이 고려의 표준 정의 예상 변화, 그러한 변화 (어떤 결과를 생각 하지만 생물학과 기술적인 변동23의 조합)에서 필연적으로 생성 하지 확실히 시너지 결과의 신뢰성에 대 한 합니다. 시너지 테스트용 설립된 품질 관리 기준의 부족은 또한 현재 제한 이다. 아마도 모든 시너지 테스트 방법의 가장 중요 한 제한 때 생체 외에서 결과 임상 결과 사이 설립된 상관 관계의 부족 조합 환자24치료 하는 데 사용 됩니다. 간단 하 고 더 빠른 시너지 메서드를 여기에, 설명 하는 자동된 바둑판 배열 방법 테스트 하기 위해서는 더 나은 임상 시험 또는 환자 결과의 다른 평가 테스트 생체 외에서 시너지의 통합 촉진 수 있습니다. 미래에 생체 외에서 그리고 vivo에서 효과 사이의 관계를 특징.
우리가 여기에 제시 하는 자동화 된 바둑판 배열 메서드 높은 처리량 검열의 다양 한 조합에 대 한 옵션을 제공 하 고 시간의 주요 투자 없이, “높은 위험 높은 보상” 조합의 빠른 평가 허용 하 고 자원입니다. 우리는 이후에 설명 하는 시간-죽 일 방법 결합의 시너지 활동에 추가 지원 정보를 제공할 수 있습니다 고의 살 균 활동 및 항균 활동을 특성화 하는 데 도움이 수 있습니다.
여기 설명 하는 두 가지 방법 모두는 그들의 개별 활동에 비해 사용 하는 제 활동에 대 한 정보를 제공 합니다. 자동된, 잉크젯 프린터 기반 디지털 시간 죽 일 방법은 더 밀접 하 게 같은에서 해당 프로토콜을와 하는 동안 임상 미생물학 절차 핸드북33에서 설명 하는 방법의 적응은 분배 방법 34참조.
바둑판 배열 방법에서 각 잘 추가할 항균 재고의 필요한 볼륨 뿐만 아니라 이러한 볼륨의 분배를 결정 하는 계산 자동화 된다, 따라서 설명서에 발생 하는 오류의 주요 잠재적인 소스 중 일부를 제거 바둑판 배열입니다. 그러나 여전히 필수적 이다,, 그는 탐정 결정 원래 주식 의도 농도에서 만들어집니다 목표 최종 농도 D300 소프트웨어에 올바르게 입력 됩니다. 384-잘 접시에 웰 스 항균 정지 처음에 어려울 수 있습니다 및 개호 추가 되도록 그 피 펫 팁 적절 한 우물을 입력 하 고 우물의 가장자리를 그 액체에서 물보라를 하지 않습니다. 자동된 액체 처리기 증가 속도 정확성 있는 세균 현 탁 액 우물에 추가 하는 휴대용 멀티 채널 피 펫 대신 사용할 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 대로 D300 계면 활성 제, 폴 20 (P-20), 적절 한 액체 처리의 추가 요구 한다. 다른 계면 활성 제, 폴 80, 0.002%의 농도에 colistin 마이크와 유기 체를 위한 colistin 마이크 낮은 지적 하고있다 < 표준 국물 microdilution 분석 실험에서 2 µ g/mL. 35 , 36 우리의 실험실 이전 시연 하는 농도 0.0015% 했다 D300 기반 마이크와 비교 결과에 영향을 주지 않습니다 P-20 BMD14참조. 여기에 제시 된 분석 결과 예제에서 최대 P-20 농도 0.0014%입니다.
일부 바둑판 배열 분석 우리가 발생 한 1 개의 문제는 건너뛴된 우물의 많은 수 이었다. 이 특정 항생제로 과도 한 속도로 발생 했습니다. 특히, carbapenem 저항 Enterobacteriaceae의 컬렉션에 대 한 조합의 화면에서 우리는 동안 발견 521 재판 (9.4%)의 49 여러 건너뛴된 웰 스, 인해 사용할 수 없었던 2 12 항생제의 테스트 (fosfomycin 및 cefepime) 46 이러한 시련 (94%)를 차지 했다. 이러한 증가 속도 inoculum 효과31,,3237될 약물에 더 가능성이 있을 수 있습니다. 노트, CLSI 국물 희석25 결과의 신뢰성에 대 한 우려 때문에이 약으로는 신뢰할 수 없는 결과 설명할 수 있습니다이 방법으로 fosfomycin를 테스트 권장 하지 않습니다. 일부 수정 탐정 찾아보십시오 자동된 바둑판 메서드를 만들 수 있습니다. 제 경우 워크플로 실험실 내에서 이유를 빈 우물에 보다는 오히려 이미 세균 현 탁 액을 포함 하는 접시에 적절 될 수 있습니다. 384-잘 접시는 여기 사용 되었다, 하는 동안 메서드 수 있습니다 또한 실시 96 잘 접시 분석 잘 볼륨의 적절 한 수정에. 96 잘 접시 형식의 특히 inoculum에 작은 변화에 민감한 항생제에 대 한 줄이는 건너뛴된 우물에 도움이 수 있습니다. FIC내가계산할 때 마이크가 상황에서 규모 (즉, 테스트 보다 더 높은), 약물 테스트는 테스트 되 고 유 기체의 유형에 대해 개별적으로 활동이 상황 등 있을 수 있습니다. 이러한 경우에는 FIC 수 수에 따라 계산 마이크 테스트 하는 가장 높은 농도 보다 높은 한 희석을 가정. 이것은 가장 보수적인 전략 저해 시너지 테스트 중 관찰은 어떤 희석에 대 한 최대 가능한 FIC 값을 가정 합니다. 예를 들어 실제 마이크 대신 위의 두 배로 희석 했다 높은 농도 테스트, 다음 해당 금융 고 보수적인 할당 보다 낮은 두 배 것.
정확 하 게 분석 결과 시간-죽 일에에서 약의 살 균 활동 평가, 특히 때 세포 벽 활성 항생제는 테스트28문화 로그 단계 성장 될 필수적 이다. 떨고 가진 외피의 3 시간 (K. 균),이 예제에 사용 되는 빠르게 성장 하 고 박테리아에 대 한 적절 한이 성장 단계에 도달 했지만 다른 양의 시간 다른 생물에 필요한 수 있습니다. 일반적으로 문화는 가시만 하지 무 겁 게 탁 표시 되어야 합니다. 시간의 적절 한 금액은 식민지 수 직렬 시간 포인트 (예: 매 30 분 4-6 시간)38에서 성장 곡선을 구성 하 여 확인할 수 있습니다. 시간 죽이기 연구에서 의도 시작 inoculum도 중요 하다. 시작 inoculum의 대상 농도 약 5 x 105 1 x 106 CFU/mL입니다. 여기에 설명 된 희석 (미디어 10 mL에 1.0 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 100 μ) Klebsiella 균 및 우리가 그것을 테스트는 다른 Enterobacteriaceae 종이이 inoculum을 생성 합니다. 다른 유기 체를 사용 하 여 실험에서 시작 inocula의 밀도 크게 이것 보다 낮거나 높은 경우 다른 희석 필요할 수 있습니다. (특정된 종에 필요한 적절 한 희석 수 확인할 수 0.5 또는 1.0 맥 팔 랜드 정지의 격판덮개 조사를 수행 하 여이 탁 대표는 초기 정지 해야 하는 금액을 계산 하는 얼마나 많은 유기 체를 확인 하 적절 한 최종 농도 도달 희석.) 있으면, 시너지 연구에서 접시의 검토, 항생제 포함 된 튜브의 시작 inoculum 성장 제어의 시작 inoculum 보다 훨씬 낮은 되었습니다,이 중 항생제 carryover 나타낼 수 있습니다 또는 매우 신속한 죽 여 박테리아의 도금에 대 한 항생제 포함 된 튜브에 박테리아의 추가와 제거는 약 수의 짧은 시간에. 낮은 후속 희석에 식민지의 수보다 undiluted 드롭 시리즈에 있는 식민지의 실제 수 이면이 항생제 carryover 효과 제안 합니다. 다른 옵션 전체 플레이트38 이상의 단일 약 수를 확산 하거나 샘플 아래로 회전 하 고, 상쾌한를 제거 하 고 다시39도금 전에 메 마른 염 분에서 중단을 포함 하 여이 효과 방지 하기 위한 설명 되어 있다. 각 시간이 시점에서 시간 죽 일 방법에서 그것은 또한 효율적으로 하지만 정확 하 게 각 문화 관에서 한 약 수를 제거 하 고 직렬 희석을 수행 하는 조사에 대 한 중요 한. 이 과정 동안, 특히에, 발생 하는 초기 시간 점 동안 지연 장기간 동안 문화 되지 않습니다 발생할 수 있습니다 incubated 고 흔들리고, 부주의 한 분배 및 직렬 희석 부정확 한 접시를 이어질 수 있는 반면 계산합니다. 확산 판 방법 접시 계산, 각 희석의 100 μ 전체 한 천 격판덮개 전염 됩니다에 비해 설명 드롭 플레이트 메서드는 훨씬 더 빠른, 훨씬 적은 수의 한 천 배지, 필요 하 고 최대도 빠른 계산에 대 한 허용 각 드롭에 대 한 식민지의 수 수는 30, 최대 300 식민지 일반적으로 확산 판에서 계산 될 수 있는 반면입니다. 그러나, 확산 판 메서드 수 사관이 기술을 더 편하다면 옵션 또한입니다. 상품 멀티 채널 피 펫 분배 후 서로 확산, 단일-채널 피 펫 더 넓게 간격 둔된 상품의 개별 응용 프로그램 대신 수행할 수 있습니다. 우리의 경험에 과도 한 확산을 줄이기 위해 듯 방울을 분배 하기 전에 4 ° C에서 격판덮개를 냉각.
여기서 설명의 한 가지 한계는 두 가지 유형의 시너지 효과 분석 결과 (바둑판 배열 및 시간-죽 일)의 결과 항상 조화 된, 이후 가장 시너지는 기사로 출판된 한 메서드 또는 다른 보다는 모두 함께 사용, 그것은 수 있습니다. 두 가지 유형의 분석에서 데이터를 통합 하는 방법을 알고 어려울. 때문에 우리가 개발 자동화 된 바둑판 배열 방법 간단 하 고 높은 처리량, 우리 사용 효과 스크린의 일종으로 격리의 큰 숫자에 대 한 조합을 테스트 하 고 어떤 농도 조합 했다 시너지 결정 하. 우리는 다음 조합 및 농도 바둑판 배열에서 효과적인 선택 시간 죽 일 연구의 더 작은 수 수행. 메모의 바둑판 분석 결과 일반적으로 수행 microbroth 희석 배율에 시간-죽 일 분석 결과 사용 큰 볼륨 (와 유사한 macrobroth 희석), 때문에 우리는 발견 금융 때때로 두 방법 사이 다른와 더 높은 일반적으로 필요한 시간 죽 일 분석 결과에서 활동을 설명 하 한 농도 이 현상을 언급 되었습니다 이전 macrobroth 및 microbroth 희석 마이크 시험 결과 그람 음성 이십시오26 한 때 더 큰 inocula (시간 죽 일 연구에 사용)는 비교에 사용 되는 표준 inoculum와 비교 했을 때 microbroth 희석과 바둑판 배열32분석 실험. 바둑판 배열의 특정 한계 microbroth 희석 마이크 테스트22에 내재 된 다양성 이다. FIC나 차단 시너지 계정으로이 변화 하면서 수학적6 같은 가변성 필연적으로 제기 하지 신뢰성과 바둑판 배열 결과의 일관성에 대 한 우려.
테스트 방법 (인공 성장 매체, 정적 항생제 농도, 그리고 제한 된 시간 코스에 박테리아의 경작을 포함 하 여) 모든 체 외 시너지에 제한으로 인해 이러한 방법으로 얻은 결과 확인 해야 합니다 및 추가 보조 기술을 사용 하 여 평가. 이러한 방법을 포함 체 외 pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) 연구 (예를 들어, 빈 섬유 감염 모델40), 동물 모델, 그리고, 궁극적으로, 인간의 PK/PD 및 효능 연구. 여기, 잠재적인 시너지 활동 화면 조합에 있는 급속 한 메서드를 제공 하 여 설명 하는 자동화 된 바둑판 배열 방법을 더 허용 이러한 기술 활용 대상. 더 생체 외에서 매개 변수 및 임상 결과 사이 관계의 더 잘 체계적인 조사로 모든 이러한 방법의 자동화 확장에 중요 한 것을 테스트 하 고 그것의 임상 적용을 증가 하는 시너지 효과 사용 하 여.
The authors have nothing to disclose.
Thea 브 레 넌-Krohn 여는 유 니스 케네디 슈 라이버 건강의 국립 연구소 아동 지원 및 훈련 그랜트 (T32HD055148), 알레르기 국립 연구소와 전염병 교육 그랜트 (인간 발달 소아과 감염 증 연구 T32AI007061), 보스턴 어린이 병원 사무실 교수 개발 교수 경력 개발의 친교, 그리고는 알레르기 국립 연구소와 전염병 경력 개발 상 (1K08AI132716). J.E.K.는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 보너스 번호 R33 AI119114에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Escherichia coli strain ATCC 25922 | ATCC | 25922 | QC strain |
0.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
1 L 0.22 µm bottle-top filter | Thermo Scientific Nalgene | 597-4520 | |
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Fisherbrand | 14-961-26 | |
15 mL conical tubes | Phenix | SS-PH15 | |
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates | Thermo Scientific | R01620 or R04050 | |
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes | Bellco | 2005-02512 | |
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes | Bellco | 2011-25150 | |
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids | Greiner Bio-One | 781186 | |
50 mL conical tubes | Phenix | SS-PH50 | |
50 mL sterile reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells | Fisherbrand | 12-566-612 | |
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids | Evergreen | 222-8032-01R | |
Cation adjusted Mueller Hinton broth | BD Diagnostics | 212322 | |
Colistin sulfate | Alfa Aesar | J60915 | |
D300e Control Software | HP/Tecan | ||
DensiCHEK Plus McFarland reader | bioMérieux | 21250 | |
Excel spreadsheet software | Microsoft | ||
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips | Denville Scientific | P1096-FR | |
HP D300 digital dispenser | HP/Tecan | ||
HP D300 T8+ cassettes | HP/Tecan | 30097370 | |
Minocycline hydrochloride | Chem-Impex | 14302 | |
Picus 12-channel 10-300 µL pipette | Sartorius | 735461 | |
Polysorbate 20 | Fisher Bioreagents | BP-337 | Brand name: Tween 20 |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 PRO | |
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette | Eppendorf | 2231000328 |