Wij bieden een methode voor de generatie, de teelt en de systematische analyse van organotypic plakjes afgeleid van lymfkliertest Long tumoren. Ook beschrijven we hoe u kunt optimaliseren voor segment dikte en drug concentraties te behandelen tumor segmenten te selecteren.
Organotypic primaire explant weefselcultures, waaronder precisie-cut segmenten, vertegenwoordigen de drie-dimensionale (3-D) weefsel architectuur evenals de meercellige interacties van inheemse weefsel. Weefsel segmenten onmiddellijk gesneden uit vers gereseceerd tumoren behouden ruimtelijke aspecten van de heterogeniteit van de intratumor, waardoor ze nuttig surrogaten van in vivo biologie. Zorgvuldige optimalisatie van weefsel segment voorbereiding en teelt voorwaarden is van fundamenteel belang voor de voorspellende diagnostische mogelijkheden van tumor segment explants. In dit verband zijn lymfkliertest modellen waardevol, zoals deze bieden een consistente stroom van tumor materiaal repliceren en reproduceerbare experimenten uit te voeren. Dit protocol beschrijft het kweken van lymfkliertest Long weefsel tumor afkomstige segmenten met behulp van een roterende incubatie-eenheid, een systeem waarmee intermitterende blootstelling van weefsels aan zuurstof en voedingsstoffen. Onze vorige werk is gebleken dat het gebruik van de roterende incubatie eenheden de levensvatbaarheid van weefsel ten opzichte van andere methoden om cultuur verbetert, met name drijvende segmenten en stagnerende filter ondersteunt. Hier, laten we verder dat segment dikte de levensvatbaarheid beïnvloedt van gekweekte segmenten, suggereren dat optimalisatie met de dikte van het segment gedaan moet worden voor verschillende weefseltypes (HLA). Uitgesproken ITH in relevante oncogene functies, zoals activiteiten, stromale cellen infiltratie of expressie van differentiatie markers, signalering vereist evaluatie van aangrenzende weefsel segmenten voor de expressie van markers gewijzigd door medicamenteuze behandeling of teelt zelf. Kortom, dit protocol beschrijft de generatie van lymfkliertest Long tumor segmenten en hun cultuur op een roterende incubatie-eenheid en toont hoe segmenten moeten systematisch worden geanalyseerd voor de expressie van heterogene weefsel markers, als een voorwaarde voorafgaand aan de drug reactie studies.
Solide tumor weefsel, met inbegrip van longkanker, genetische en fenotypische heterogeniteit vertonen, en haven van complexe microenvironments1,2. Het samenspel tussen de tumorcellen en hun omliggende communicatie invloed op drug gevoeligheid en resistentie mechanismen3. Dit wijst op de noodzaak voor preklinische modellen die kan nauwkeurig model van biologische complexiteit en functies handelen in native tumoren. Precisie-cut segmenten direct afgeleid van verse tumoren bieden een unieke bron, zoals ze een belangrijkste capaciteit om te vertegenwoordigen in vivo biologie, ten minste voor een korte venster van tijd hebben, met inbegrip van fenotypen ruimtelijk verspreid in een individuele tumor. Gereseceerd klinische tumoren zijn een van de paar gepersonaliseerde specimens die kunnen worden verkregen bij een kankerpatiënt, en hun diagnostisch gebruik verdient toetsing.
De geschiedenis van organotypic culturen dateert uit het begin 19e eeuw, toen de menselijke intracraniële tumoren waren hand-cut in weefsel stukjes en gekweekte met behulp van de zogenaamde opknoping drop, methode. Weefsel fragmenten werden gekoppeld aan een dekglaasje aan en kunnen duik in EDTA menselijk plasma, waarna de coverslips werden omgekeerd, verzegeld en gekweekte voor verscheidene weken4. Handmatig snijden tumor stukken hebben sinds gekweekt met behulp van een verscheidenheid van andere methoden, zoals op plasma stolsels5, in vloeibare media6, of op 0,45 µm porie grootte filters6. De term “organotypic” werd voor het eerst gebruikt in 1954, in een studie over retinale differentiatie van de chick embryo oog7. Dit werd gevolgd door studies die longen en hart weefsel explantaten afgeleid van chick embryo’s8en hersenen explantaten van volwassen ratten9gebruikt.
Verschillende segmenteringshulplijnen methoden zijn beschreven, namelijk handmatig choppers10,11, Krumdieck weefsel slicer12,13en vibratomes11,14,15, 16. De Krumdieck weefsel slicer genereert cilindrische weefsel kernen, die vervolgens worden gesneden in plakjes van de circulaire weefsel gebruikend microtome. Een vibratome, aan de andere kant, maakt gebruik van een vibrerende microtoom blade. In een studie over de lever segmenten, werd aangetoond dat de Leica-vibratome meer reproduceerbare en consistente segmenten in vergelijking met de Krumdieck snijmachine15 genereert. Segment diktes variërend van 250 tot 500 µm zijn opgebruikt, en studies rapporteren onderhoud van uitvoerbaarheid en morfologische kenmerken zelfs tot 16 dagen14,10,17,18. Echter tumoren variabele metabolische profielen die voedingsstof eisen kunnen beïnvloeden, en parameters zoals weefsel stijfheid en matrix samenstelling kunnen invloed hebben op beluchting en nutriënten stroom. Het is daarom waarschijnlijk dat elk weefseltype optimalisatie van snijden en cultuur voorwaarden vereist.
Verschillende cultivatiemethoden zijn gebruikt ter ondersteuning van segment culturen: ik) stationaire interfase cultuur, een afkorting voor stagnerende ondersteuning cultuur, waarin segmenten worden geplaatst op de top van een semi-poreuze membraan invoegen ondergedompeld in het kweekmedium. In deze, wordt de top van de segmenten blootgesteld aan de lucht, terwijl de onderkant wordt aangevuld met voedingsstoffen via de poreuze invoegen14,19; II) de methode Troffel, oorspronkelijk ontwikkeld om cultuur hele organen of embryonaal weefsel segmenten. In deze segmenten worden geplaatst op de top van een blad van katoen of filter ondersteund door een metalen rooster en het filter is gedrenkt in het kweekmedium. Om het weefsel vochtig, wordt een dunne laag van medium toegevoegd op de top van de segmenten20,21,22. Deze eerste twee zijn zogenaamde lucht-liquid interfase culturen; III) roller buis culturen, waarin segmenten worden geplaatst binnen de platte kant van een plastic buis met middellange en langzame buis rotatie zorgt ervoor dat het weefsel is bedekt met middellange tijdens het eerste deel van de cyclus of tijdens de tweede23 belucht; IV) roterende incubatie eenheden, die segmenten met tussenpozen worden blootgesteld aan medium met voedingsstoffen en beluchting. Anders dan roller buizen, in deze methode segmenten worden geplaatst op de top van poreuze titanium rasters in 6-Wells-platen met voedingsbodem24geplaatst.
Weefsel segmenten afgeleid van gereseceerd stevige tumors logisch aanwezig een aantrekkelijke ex vivo model waarin voor het testen van de reactie van de behandeling van anti-kanker agenten, zoals zij toestaan dat de evaluatie van levensvatbaarheid, gerichte traject activiteit, en Moleculaire profielen van een specifieke tumor in aanwezigheid van de oorspronkelijke tumor communicatie. Om te beoordelen of de reacties van de drug gemeten in tumor segmenten voorspellende van in situ reacties zijn, is het echter belangrijk om te beoordelen in welke mate weefsel segmenten tumor-specifieke biologische functies zoals celproliferatie behouden, histopathologisch onderzoek-specifieke celdifferentiatie of oncogene signalering activiteiten. De gevolgen van mechanische stress ontlokte tijdens segment voorbereiding, segment behandeling of cultuur-geïnduceerde aanpassingen voor zowel de kwaliteit en de biologische functies van weefsel segmenten zijn fundamentele vragen, strak gekoppeld aan de mogelijkheid om de tumor afkomstige segmenten voor functionele diagnostiek.
Onze consortium IMI-gefinancierd project PREDECT (http://www.predect.eu) wordt systematisch adres deze fundamentele vragen, door het bestuderen van segment explantaten uit een verscheidenheid van bronnen. Segmenten die zijn afgeleid van borst-, prostaat- en longkanker-kanker-modellen te gebruiken, deze gezamenlijke inspanning gebruikt kwalitatieve read-outs evenals kwantitatieve haematoxyline en eosine (H & E) – gebaseerd uitlezingen om aan te tonen van een vereiste voor atmosferische zuurstof en stagnerende filter steunt om te houden van de levensvatbaarheid van gekweekte segmenten tot 72 uur. Bovendien, immunohistochemistry (IHC) analyses op gekweekte segmenten geopenbaard intra-delige levensvatbaarheid verlopen, blijkt als necrose verlopen in plakjes afgeleid van lymfkliertest niet-kleincellige longkanker (NKCLK), oestrogeen receptor (ER), HIF1α en γH2AX kleurovergangen in borst kanker plakjes of androgeen receptor (AR) expressie verlopen in prostaatkanker segmenten25. Interessant, intra-delige levensvatbaarheid verlopen in 24 h culturen van lymfkliertest NKCLK werden gered door de teelt in een roterende incubatie-eenheid, en onze recente studie toonde aan dat de levensvatbaarheid werd uitgebreid tot 72 h26. Met name de bovenzijde bleef meest haalbare26, onderschrijven dat drug reactie op segmenten zijn beste analyses uitvoeren aan deze kant van het weefsel.
Ook al blijft het een vraag hoe ver weefsel segmenten in situ tumor functies kunnen recapituleren, zij zijn uitgebreid gebruikt voor het testen van de reacties op de anti-kanker agenten, met inbegrip van gerichte drugs, monoklonale antilichamen en chemotherapie agenten 10,11,13,14,18,27. We toonden onlangs dat lymfkliertest NKCLK segmenten dynamische veranderingen in proliferatie tonen en oncogene signalering activiteiten na teelt in vergelijking met vers gesneden 0 h plakjes26. Dit geeft aan dat het belangrijk is te onderzoeken of de biologische functies gericht in situ op de juiste wijze worden bewaard tijdens de teelt, vóór perturbation studies. Ondanks deze bevindingen, we toonden dat tumor segmenten model kunnen maken ruimtelijke reactie op gerichte therapieën, Midden drug behandelingen blijven korte (24u) en worden gestart bij het begin van het kweken van26. Het volgende protocol beschrijft belangrijke validatie aspecten die relevant zijn voor de totstandbrenging en de analyse van tumor segment culturen, voorafgaand aan hun toepassing in farmacologische drug testen.
Verschillende complexe in vitro tumor modellen, waaronder 3D culturen en organoids, zijn ontwikkeld om te recapituleren, de architectuur en oncogene functies van in vivo tumor weefsel29,30. Echter, de totstandbrenging van 3D culturen of organoids inhoudt weefsel dissociatie en selectieve groei van een eencellige type of co cultuur van een select aantal celtypes in een kunstmatige omgeving. Dientengevolge, vangen dergelijke modellen onvolledig de fijne kneepjes van tumor heterogeniteit en tumor-stroma interacties. Organotypic tumor segmenten, aan de andere kant, handhaven de weefsel architectuur en biologische complexiteit van de in situ tumor, zonder uitgebreide manipulatie. Dit vermogen van weefsel segmenten model tumorcellen in hun eigen communicatie maakt hen bijzonder aantrekkelijk voor preklinische studies. We eerder gemeld een geoptimaliseerde workflow voor de vaststelling en analyse van precisie-cut tumor segmenten, en toonde aan dat, in vergelijking met filter ondersteunt, een roterende incubatie-eenheid verbetering van de levensvatbaarheid van korte termijn lymfkliertest NKCLK segment culturen25 , 31. echter, teelt op roterende eenheden is technisch uitdagende en vereist een voortdurende controle. Wij presenteren hier een protocol voor tumor weefsel segment generatie en praktische gebruik van een roterende incubatie eenheid tot cultuur hen, evenals begeleidende methoden voor het controleren van de mogelijkheid van segmenten te vangen in situ tumor biologie, een voorwaarde voorafgaand aan drugs reactie testen.
Verschillende kritische stappen in het protocol garanderen van weefsel integriteit en levensvatbaarheid van de segmenten van de tumor. Als normale longweefsel de tumor omringt, kan de vibratome genereren segmenten met inconsistente dikte of schade van de segmenten, als gevolg van verschillen in textuur en stijfheid tussen normaal en tumor weefsels. Het is dus belangrijk om te verwijderen van het omliggende normale longweefsel vóór de tumor snijden. Een andere belangrijke stap is het snijden dikte, en die zorgvuldig moet worden geoptimaliseerd voor elk weefseltype. Bovendien, zodra gesneden, is het essentieel dat het segment ongeveer in het midden van het raster ligt, om zo ervoor te zorgen nauwkeurige intermitterende dompelen in cultuurmedium en zuurstof blootstelling. Tenslotte is het belangrijk dat u de positie van een segment volgt tijdens de geldigheidsduur van de rotatie, als een segment kan drop down in aan het medium; Als dit gebeurt, kunnen verdere acties worden ondernomen zoals beschreven in stap 3.6 van het protocol.
Naast weefsel die verwerken te verzekeren van de integriteit, zijn er ook kritische stappen in de analyse van de IHC te interpreteren hoe het segment lijkt op het oorspronkelijke weefsel. Onze vorige studie toonde aan dat lymfkliertest NKCLK tumoren tot ruimtelijke heterogeniteit uitgesproken intra-tumor in oncogene signalering activiteiten26 vertonen. Dit betekent dat het gebruik van ruimtelijk gescheiden weefsel voor besturingselementen segmenten of drug-behandelde monsters kunnen invloed hebben op betrouwbare experimentele data interpretatie, en vandaar nauw aangrenzende segmenten moeten worden gebruikt als besturingselementen en proefmonsters. We toonden dat verder terwijl proliferatie of oncogene phosphoprotein expressie in vers gesneden onbeschaafd 0 h plakjes waren vergelijkbaar met in situ tumoren, gekweekte segmenten toonde veranderde oncogene phosphoprotein expressie, specifiek veranderde p4EBP1 en pSRC, evenals gewijzigde proliferatie geanalyseerd door Ki67 IHC. Gewijzigde p4EBP1 expressie is ook aangetroffen in 24 h menselijke NKCLK en prostaatkanker slice culturen (Narhi et al.., aanvullende figuur S3B-S3C, S5 en S7)26. Deze bevindingen onderschrijven dat vergelijking van gekweekte segmenten met hun dichtstbijzijnde 0 h onbeschaafd segment cruciaal is voor het behoud van in situ tumor functies in gekweekte plakjes beoordelen.
Ondanks de verbetering van de levensvatbaarheid van organotypic plakjes25, zijn er beperkingen met de rotator-systeem in termen van technische details. Plaatsen van de plakjes weefsel op titanium rasters is moeilijker in vergelijking met filteren inzetstukken en een roterende incubatie-eenheid mogelijk niet beschikbaar. Als alternatief, stagnerende filter ondersteunt kunnen worden gebruikt, maar in dat geval alleen de lucht-blootgesteld kant van de segmenten moet worden geanalyseerd, zoals lucht-naar-filter verlopen in de levensvatbaarheid en hypoxie gemeten door HIF1α expressie worden snel gevormd in filter-ondersteunde segment culturen (Davies et al.., figuur 5 en figuur 7A-7B)25. We hebben verder aangetoond dat de tumor segment culturen vertonen kunnen veranderde proliferatie en oncogene signalering activiteiten ten opzichte van hun inheemse tumoren26, mogelijk vanwege de wondgenezing reacties of metabole aanpassing van de segmenten ex vivo 32cultuur. Hoewel bruto morfologische kenmerken van de lymfkliertest NKCLK tumoren werden onderhouden tijdens 72 h teelt, kan cultuur-geïnduceerde proliferatieve wijzigingen nauwkeurige sortering van de gecultiveerde segmenten. Dus, weefsel segmenten moeten alleen worden gebruikt voor korte termijn functionele studies.
Gebruik van een roterende incubatie-eenheid redt op zijn minst gedeeltelijk intra-delige levensvatbaarheid of biomerker expressie verlopen, met name tijdens de eerste 24 h van cultuur. Eenmaal gevalideerd voor integriteit en functie, biedt dit weefsel materiaal voor functionele studies, zoals drug behandeling studies. Naast de reactie drugsprofielen, kan gewijzigde doelwit expressie na medicamenteuze behandeling ook profiteren van antilichaam validatie. Dit is vooral relevant voor de detectie van lymfkliertest epitopen met muis monoklonale antilichamen, omdat deze de neiging om hoge kleuring achtergrond geven. Bovendien, zijn goed gevalideerde antilichamen noodzakelijk om betrouwbare en reproduceerbare gegevens in diagnostische en klinische instellingen. Modulatie van de overvloed of fosforylatie van relevante epitopes na medicamenteuze behandeling in weefsels plakjes biedt dus een handige praktische toepassing in antilichaam validatie. Een groot voordeel van tumor segment culturen is de mogelijkheid om model ruimtelijk-verdeelde functies, met inbegrip van oncogene signalering activiteiten of drug reactie in de tumor of stromale cellen, waardoor ze een aantrekkelijke ex vivo -model. Echter segmenten draaien tijdens de teelt, en het proces van de teelt kan verdere schade aan het weefsel met name aan de randen. Het is daarom uitdagend op juist overlay de biomerker gebeitste IHC beelden van 0 h segmenten met de necrotische regio’s ontdekt in gekweekte plakjes, die de mogelijkheid maken juist ruimtelijke biomerker activiteiten naar een reactie van de drug in het gedrang brengt. Daarnaast, zijn tumor-intrinsieke-, cultuur-geïnduceerde en drug-geïnduceerde necrotische reacties niet te onderscheiden ten minste in lymfkliertest NKCLK weefsel segmenten, nauwkeurige kwantificatie van ruimtelijke drug reacties in gevaar te brengen. Tot slot, het gebruik van tumor segment culturen toelaat een onderzoeker aan de test meerdere verbindingen op de dezelfde tumor, zonder de noodzaak voor de behandeling van dieren, dus verfijnen, verminderen en experimenten met proefdieren vervangen.
Als een toekomstige toepassing, kan het protocol beschreven klinische solide tumor monsters worden vastgesteld. Verder zijn leveringsoptimalisatie of weefsel type-afhankelijke wijzigingen waarschijnlijk nodig, beginnend met de aanpassingen aan de instellingen van de vibratome met inbegrip van segment dikte en trillingen snelheid optimaliseren deze voor tumor textuur of stijfheid. Daarnaast kan nutriënt en groeifactor eis variëren voor verschillende tumor weefsels. Als voorbeeld hebben borst kanker segmenten zijn gekweekt met insuline aangevuld in de middelgrote13,–18. Gezien het feit dat beperkte weefsel materiaal wordt verkregen tijdens chirurgie of biopsie, kan optimalisatie van patiënt-afgeleide tumor segment culturen lastig zijn als gevolg van moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende aantallen monsters. Bovendien, reproduceerbaarheid van de gegevens is ook uitgedaagd door uitgesproken patiënt-te-patiënt voorbeeld heterogeniteit, met name in het percentage van tumorcellen versus fibrotische regio’s of stromale infiltreert, alsmede onderdelen van necrotisch weefsel. Ten slotte zou de toepassing van tumor segmenten in Diagnostische instellingen onderzoek van de omvang aan welke drug reacties in segment explantaten voor de voorbehandeling biopsieën wedstrijden aan nabehandeling in vivo reacties vereisen.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werk ontvangen financiële steun van innovatieve geneesmiddelen gemeenschappelijke onderneming voor het initiatief verlenen overeenkomst no 115188, de Universiteit van Helsinki Doctoral programma biogeneeskunde beurzen (A.S.N.) en de Sigrid Juselius en Orion-Farmos stichtingen (E.W.V.). Wij bedanken onze PREDECT weefsel segment platform Consortiumleden (Taija af Hällström en Siv Knaappila voor steun bij het opzetten van de rotator-systeem en Riku Turkki voor ondersteuning bij de MATLAB-analyse. Jouko Siro is bedankte voor het vastleggen van de foto’s van figuur 1. Wij danken het team FIMM WebMicroscope voor het scannen van de histologische dia’s, en ondersteuning van het laboratorium dier centrum voor veeteelt.
Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
PBS | Lonza | BE17-517Q | |
Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
Citric acid | Sigma | C1909 | |
PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
Eosin | Sigma | E4382 | |
NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |