Técnicas de microescala Phenotyping de maíz haces vasculares basados en tomografía de rayos x Microcomputed
Summary
Ofrecemos un novedoso método para mejorar el contraste de la absorción de rayos x del maíz tejido adecuado para la exploración de la tomografía de la microcomputed ordinaria. Basado en imágenes del CT, presentamos un conjunto de flujos de trabajo de procesamiento de imágenes para diferentes materiales de maíz extraer efectivamente fenotipos microscópicos de haces vasculares del maíz.
Abstract
Es necesario cuantificar con precisión las estructuras anatómicas de maíz materiales basados en técnicas de análisis de imagen de alto rendimiento. Aquí, ofrecemos un ‘protocolo de preparación de muestra’ para materiales de maíz (es decir, tallo, hoja y raíz) convenientes para los microcomputed exploración de la tomografía (micro-CT). Basado en imágenes de alta resolución CT de tallo, hoja y raíz, Describimos dos protocolos para el análisis fenotípico de los haces vasculares: (1) basado en la imagen de CT de tallo y hoja, hemos desarrollado una tubería de análisis de imagen específica para extraer automáticamente 31 y 33 rasgos fenotípicos de haces vasculares; (2) basado en la serie de imagen de CT de maíz raíz, configurar un esquema de procesamiento de imagen para la segmentación (3D) tridimensional de los vasos metaxylem y extrae dos dimensiones (2-D) y 3-d características fenotípicas, tales como volumen, superficie de embarcaciones metaxylem, etc. En comparación con la medición manual tradicional de haces vasculares de materiales de maíz, los protocolos propuestos mejoran significativamente la eficiencia y la exactitud de la cuantificación fenotípica de la escala del micrón.
Introduction
El sistema vascular maíz recorre toda la planta, de la raíz y el tallo a las hojas, que forma las rutas de transporte clave para la entrega de agua, nutrientes minerales y sustancias orgánicas1. Otra función importante del sistema vascular es proporcionar soporte mecánico para la planta de maíz. Por ejemplo, la morfología, número y distribución de haces vasculares en raíces y tallos están estrechamente relacionados con la resistencia del alojamiento de plantas de maíz2,3. En la actualidad, estudios sobre la estructura anatómica de haces vasculares utilizan principalmente microscópicas y ultramicroscópicos técnicas para visualizar las estructuras anatómicas de una cierta parte del tallo, hoja o raíz y luego medir y contar estas estructuras de interés por la investigación manual. Sin duda, medición manual de diferentes estructuras microscópicas en microfilmes a gran escala es un trabajo muy tedioso e ineficiente y limita seriamente la precisión de microphenotypic rasgos, debido a su subjetividad y la inconsistencia4, 5.
Maíz no tiene crecimiento secundario, y el contenido de la celda consiste esencialmente de agua en el meristemo primario. Sin ningún tratamiento previo, muestras frescas de tejidos de maíz pueden ser directamente escaneadas utilizando un dispositivo micro-CT; sin embargo, los resultados del análisis son probablemente pobre y áspero. Las razones principales se resumen a continuación: las densidades de atenuación baja (1) de los tejidos de la planta, resultando en un bajo contraste de número atómico y alto nivel de ruido en imágenes; (2) materiales vegetales fresco son propensos a deshidratarse y encogimiento durante el ambiente exploración normal, según Du6. Los problemas antes mencionados se han convertido en las principales limitaciones para el desarrollo y aplicación de la tecnología de microphenotyping de maíz, trigo, arroz y otras monocotiledóneas. Aquí, presentamos el ‘protocolo de preparación de muestra’ a pretratar las muestras de tallo, hoja y raíz. Este protocolo evita la deshidratación y la deformación de materiales vegetales durante la CT exploración; por lo tanto, es beneficioso aumentar el tiempo de conservación de muestras de plantas con nondeformation. Por otra parte, el paso tintura basado en yodo sólido también mejora el contraste de materiales vegetales; así, hace mejoras significativas en la calidad de imagen de micro-CT. Además, desarrollamos software de procesamiento de imagen, llamado VesselParser, para procesar las imágenes del CT de maíz tallos y hojas. Este software integra un conjunto de tuberías de proceso de imagen para realizar análisis phenotyping automáticas y de alto rendimiento para imágenes del CT 2-D de los tejidos vegetales diferentes. Haces vasculares en la sección representativa entera del tallo y hoja se detectan, extraído e identificado utilizando un método automático de procesamiento de imágenes. Como resultado, obtenemos 31 fenotipos microscópicos de la espiga de maíz y 33 fenotipos microscópicos de la hoja de maíz. Para la serie de imagen del CT de la raíz del maíz, se desarrolló un sistema de procesamiento de imágenes para adquirir rasgos fenotípicos 3D de vasos metaxylem. Este esquema es superior en eficiencia de adquisición de imágenes y reconstrucción en comparación con los métodos tradicionales.
Estos resultados indican que la imagen de proceso tuberías teniendo en cuenta que las proyección de imagen características de ordinario rayos x micro-CT proporcionan un método eficaz para el fenotipado microscópica de haces vasculares; Esto extremadamente amplía las aplicaciones de las técnicas de TAC en ciencia de planta y mejora el fenotipado automático de materiales vegetales en resolución celular6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la aplicación exitosa de la tecnología de CT en los campos de la biomedicina y Ciencias de los materiales, esta tecnología se ha introducido gradualmente en los campos de la botánica y la agricultura, promoción de investigaciones en Ciencias de la vida vegetal como una herramienta técnica prometedora . A finales de 1990, CT tecnología primero fue utilizada para el estudio de las estructuras morfológicas y desarrollo de sistemas de la raíz de la planta. En la última década, sincrotrón TCAR se ha convertido…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China (No.31671577), la ciencia y tecnología innovación especial construcción financiado por programa de Pekín Academia de agricultura y silvicultura Sciences(KJCX20180423), la investigación Programa de desarrollo de China (2016YFD0300605-01), la Fundación de Ciencias naturales de Beijing (5174033), el Beijing Postdoctoral de investigación Fundación (ZZ 2016-66) y la Academia de Pekín de la agricultura y silvicultura Ciencias Grant (KJCX20170404),) JNKYT201604).
Materials
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
