Hier beschrijven we de isolatie van kip primaire bursal cellen uit de bursa van Fabricius, de cultuur en de infectie van de cellen met bursal infectieziekte virus, en de kwantificering van de virale replicatie.
Bursal infectieziekte virus (IBDV) is een birnavirus van economisch belang voor de pluimvee-industrie. Het virus infecteert B-cellen, waardoor morbiditeit en mortaliteit bij immuunsuppressie bij besmette vogels. In deze studie beschrijven we het isolement van kip primaire bursal cellen uit de bursa van Fabricius, de cultuur en de infectie van de cellen met IBDV, en de kwantificering van de virale replicatie. De toevoeging van kip interactie CD40-ligand aanzienlijk verhoogd celproliferatie verviervoudiging meer dan zes dagen van de cultuur en de levensvatbaarheid van de aanzienlijk verbeterde cellen. Twee stammen van IBDV, een cel-cultuur aangepast stam, D78 en een zeer virulente stam, UK661, goed in de celculturen ex vivo gerepliceerd. Dit model zal zijn voor gebruik bij het bepalen van hoe de cellen reageren op IBDV infectie en toestaat een vermindering in het aantal besmette vogels gebruikt in IBDV pathogenese studies. Het model kan ook worden uitgebreid tot andere virussen en kan worden toegepast op verschillende soorten vogels.
De globale pluimvee-industrie is essentieel voor het veilig genoeg voedsel voor een groeiende bevolking. Echter, bij immuunsuppressie is de bedreiging voor de voedselzekerheid en het welzijn van de betrokken vogels en vormt een belangrijke economische uitdaging voor de industrie. De meerderheid van de gevallen bij immuunsuppressie bij kippen worden veroorzaakt door de infectie met immunosuppressieve virussen, met de meest verantwoordelijken voor afbreuk te doen aan verworven immuniteit hebben een tropisme voor T en B lymfocyten1. Bij vogels liggen de meerderheid van de B-cellen op een orgel dat bekend staat als de bursa van Fabricius (BF). B-cellen zijn gevoelig voor infectie met verschillende immunosuppressieve virussen, met inbegrip van die veroorzaken van lysis, zoals IBDV en Marek van ziekte-virus (MDV), en degenen die het veroorzaken van transformatie, zoals aviaire leukose virus (ALV) en reticuloendotheliosis virus) REV).
Om betere strategieën voor het beheersen van deze infecties te ontwikkelen, is het essentieel te karakteriseren van de interactie van de virussen met kip B cellen. Echter, wanneer B cellen uit een vogel zijn verwijderd, ze niet overleven goed in ex vivo cultuur2, waardoor het moeilijk voor het uitvoeren van een grondige analyse van de interacties van IBDV met kip B-cellen, of de vroege gebeurtenissen na ALV of REV infectie. Bijgevolg, veel gastheer cel-virus interacties geweest studeerde in vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Hoewel deze studies informatief zijn, daarbij het gebruik van besmette vogels die lijden aan ziekten die ernstig kunnen.
De interactie CD40-ligand is een molecuul dat B cel proliferatie11 induceert. Na identificatie van het gen coderen kip CD40L (chCD40L), een oplosbare fusieproteïne werd ontworpen dat, wanneer toegevoegd aan de voedingsbodems, veroorzaakte de proliferatie van kip primaire B cellen ex vivo12. In 2015, B-cellen gekweekt op deze manier gevonden ter ondersteuning van de replicatie van MDV2 en in 2017, wij en anderen gevonden dat primaire bursal cellen gestimuleerd met chCD40L kunnen worden gebruikt als een model om te studeren van IBDV replicatie13,14. Hier beschrijven we het isolement en de cultuur van kip primaire bursal cellen, de infectie van de cellen met IBDV en de kwantificering van de virale replicatie. Hoewel we de methode in het kader van de BF beschrijven, kon dit worden toegepast op cellen isoleren en cultuur van verschillende lymfoïde organen.
In deze studie, wij beschrijven de succesvolle cultuur van kip primaire bursal cellen ex vivo in aanwezigheid van oplosbare chCD40L en aantonen dat deze cellen kunnen ondersteuning voor de replicatie van een verzwakte stam en een zeer virulente stam van IBDV. Dit ex vivo -model kan worden gebruikt om te bepalen hoe de cellen reageren op een IBDV infectie13, dat verschillende voordelen ten opzichte van in vivo en in vitro studies heeft.
Bij het verzamelen van de BF, is het cruciaal voor niet doorprikken de darm om bacteriële besmetting van de geïsoleerde bursal cellen voorkomen. Daarnaast is het belangrijk om te isoleren van de primaire cellen zo spoedig mogelijk na de oogst van de orgel te beperken van celdood. De noodzaak om het gebruik van chCD40L is een beperking van de techniek; werk uitgevoerd door Soubies et al. blijkt echter dat het gebruik van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) te verlengen van de levensvatbaarheid van de bursal cellen in plaats van chCD40L14 het model kunnen vastgesteld door een groter aantal laboratoria. Het hierboven beschreven protocol bepaalt de optimale concentratie van chCD40L empirisch, door het kweken van primaire B cellen serieel verdunde concentraties van de molecuul en observeren celproliferatie en levensvatbaarheid. Een mogelijke wijziging van het protocol kan zijn voor het zuiveren van het chCD40L molecuul en een specifieke concentratie toevoegen aan de cel voedingsbodems te vermijden-charges-variabiliteit.
In vivo studies hebben aangetoond dat volgende infectie van de IBDV, dat er is een toename van de expressie van genen die betrokken zijn bij het pro-inflammatoire cytokine reacties, Type I IFN reacties en apoptosis in de BF5,,9,10 . Echter, na infectie is er een toevloed van ontstekingscellen en effector T cellen in de BF, die verschillen in de genen die zij uitdrukken ten opzichte van de geïnfecteerde B-cel bevolking9. Het is daarom moeilijk te interpreteren hoe geïnfecteerde cellen reageren op IBDV. Om aan te pakken dit, hebben sommige onderzoeksgroepen gekenmerkt de transcriptionele reactie van cellen geïnfecteerd met IBDV in cultuur16,17,18,19,20. Deze in vitro studies hebben het voordeel van welomschreven MOIs en tijdstippen postinfection. In vitro studies hebben echter doorgaans gekenmerkt in fibroblast cellen16,17,20 of dendritische cellen18. Terwijl sommige inzicht in gastheer cel-IBDV interacties, de huidige overtuiging is dat de infectie van B-cellen cruciaal voor de pathogenese van IBDV en, dus, de relevantie van de gegevens is kan niet worden overinterpreted. Voorafgaand aan onze ex vivo bursal cel cultuur model, had slechts één studie gekenmerkt de cellulaire reactie van B-cellen op IBDV infectie19; echter, deze studie gebruikt een vereeuwigd B cellijn die was omgetoverd als gevolg van infectie met ALV, beperking van de conclusies die kunnen worden aangebracht. Daarentegen kan de ex vivo -model van IBDV infectie beschreven hier onderzoekers te behouden van de voordelen van in vitro studies, zoals de gedefinieerde MOIs en tijd-punten, terwijl het bestuderen van de interactie van het virus met de relevante gastheercel. Als de primaire bursal cellen zijn verkregen uit niet-geïnfecteerde BF weefsel, er zijn geen inflammatoire of T-cellen aanwezig, en we hebben aangetoond door stroom cytometry (met behulp van standaardvoorwaarden) dat volgende chCD40L stimulatie, 97% van de bevolking van de cel is positief voor de markering van de B-cel Bu-1 (gegevens niet weergegeven). Gezien het feit dat 3% van de cellen Bu-1 negatief, het zal interessant zijn om te bepalen of deze cellen met IBDV besmet raken en hun genexpressie en bijdrage aan de pathogenese verkennen.
Wij verwachten dat de ex vivo kip primaire bursal cel cultuur model kan ook worden uitgebreid om te bestuderen van de gastheer cel-virus interacties van andere B-cel tropic virussen infecteren van de kippen, zoals ALV of REV, en kan ook worden uitgebreid tot andere vogelsoorten ( bijvoorbeeldeenden en kalkoenen). De mogelijkheid om ook primaire bursal cellen ex vivo cultuur biedt de mogelijkheid te bestuderen van aspecten van de pathogenese en de immuunsuppressie veroorzaakt door deze virussen zonder de noodzaak om het infecteren van vogels. Als in vivo studies aanzienlijke morbiditeit veroorzaken, zal dit hebben een aanzienlijke invloed op de vervanging, verfijning en vermindering van het gebruik van dieren in het onderzoek.
Kortom, de ex vivo kip primaire bursal cel cultuur model hier beschreven heeft het potentieel om uit te breiden van het begrip van hoe aviaire B-cel tropic virussen interactie met de cellen van hun gastheer terwijl het verminderen van het aantal vogels gebruikt in in vivo studies van de infectie. De technieken kunnen worden toegepast op meerdere lymfoïde organen, meerdere virussen en, potentieel, meerdere soorten vogels, waardoor het een aantrekkelijk model dat tot de aviaire velden op het gebied van virologie en immunologie bijdragen kan.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank het Animal Services-team aan het Pirbright Instituut voor hun expertise in broedeieren fokken en de vogels en de expertise van Caroline Holt cohorten aseptisch verwijderen van de slijmbeurs van Fabricius. A.B. wordt gefinancierd door de biotechnologie en biologische wetenschappen onderzoek Raad (BBSRC) via verlenen BBS/E/I/00001845, K.D. wordt gefinancierd via de BBSRC via studententijd BBS/E/I/00002115, en A.A. wordt gefinancierd door het nationaal centrum voor de Vervanging, verfijning en vermindering van dieren in het onderzoek (NC3Rs) via verlenen NC/R001138/1.
RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56°C for 1 hour |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
0.22µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
2-Mercaptoethanol 50mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
100µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |