介绍了一种在水流下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗。我们还提供并讨论了用于获取图像的定量算法。
在口咽念珠菌病中,念珠菌属的成员必须坚持和生长在口腔粘膜表面, 而在唾液流动的影响下。虽然在流的增长模型已经开发, 许多这些系统是昂贵的, 或不允许成像, 而细胞在流动。我们开发了一种新的仪器, 使我们能够想象在流动和实时的白色念珠菌细胞的生长和发展。在这里, 我们详细介绍了该流程设备的组装和使用的协议, 以及所生成数据的量化。我们能够量化单元格附加到和从幻灯片中分离的速率, 以及确定随时间推移的幻灯片上生物量的测量值。该系统既经济又多功能, 与许多类型的光学显微镜, 包括廉价的台式显微镜, 并能延长成像时间相比, 其他流系统。总的来说, 这是一个低吞吐量的系统, 可以提供非常详细的实时信息的生物膜生长的真菌物种在流动。
白色念珠菌(C. 白念珠菌) 是人类的一种机会性真菌病原体, 可感染多种组织类型, 包括口腔粘膜表面, 导致口咽念珠菌病, 并导致受影响的个人的生活质量降低1。生物膜的形成是影响白念珠菌发病的重要特征, 对白念珠菌生物膜的形成和功能进行了大量的研究2,3,4, 5, 其中许多已使用静态 (无流)体外模型进行。然而, 白念珠菌必须坚持和生长在唾液流在口腔中存在。许多流动系统已经开发, 以允许活细胞成像6,7,8,9,10。这些不同的流系统是为不同的目的而设计的, 因此每个系统都有不同的优点和缺点。我们发现, 许多适合C. 白念珠菌的流动系统成本高昂, 需要复杂的制造部件, 或者在流动过程中无法成像, 必须在成像之前停止。因此, 我们开发了一种新的流动装置来研究11流动下的白念珠菌生物膜形成。在我们的流量仪设计过程中, 我们遵循了这些主要考虑因素。首先, 我们希望能够实时量化生物膜生长和发展的多个方面, 而无需使用荧光细胞 (允许我们轻松研究突变菌株和未修改的临床分离株)。其次, 我们希望所有部件都能在商业上提供, 几乎没有任何修改 (i. e., 没有定制制造), 允许其他人更容易地重新创建我们的系统, 并允许轻松维修。第三, 我们还希望允许在相当高的流速率下延长成像时间。最后 , 我们希望 , 经过一段时间的细胞附着到基质动 , 能够监测生物膜生长在较长的时间 , 而不引入新的细胞。
这些考虑促使我们开发了图 1所示的双瓶循环流系统。两个烧瓶允许我们将实验分为两个阶段, 一个附着阶段, 从细胞种子附着烧瓶中吸取, 以及使用无细胞培养基继续生物膜生长的生长阶段, 而无需添加新细胞。该系统设计用于显微镜的孵育室, 其前面的滑块和油管 (2 到 5,图 1) 放置在孵化器内, 而所有其他组件放置在一个大型辅助容器外显微镜。此外, 带有附加温度探针的电炉搅拌器用于保持附着烧瓶中的真菌细胞37摄氏度。由于它是循环的, 这个系统能够连续成像在流动期间 (可以超过36小时取决于条件), 并可用于大多数标准显微镜, 包括直立或倒置台式显微镜。在这里, 我们讨论了流量设备的组装、操作和清洗, 并提供了一些基本的 ImageJ 定量算法来分析实验后的视频。
使用上述流程系统, 可以生成真菌生物膜生长和发育的定量延时视频。为了使实验进行比较, 必须确保成像参数保持不变, 这一点至关重要。这包括确保为每个实验设置科勒照明的显微镜 (许多参考线可在线进行此过程)。除了成像参数, 在使用流设备时还要牢记一些重要步骤。首先, 确保气泡疏水阀在流体流动过程中保持真空, 这一点很重要, 因为如果不这样做, 将导致空气通过气泡疏水阀被拉入。同…
The authors have nothing to disclose.
作者想承认韦德博士 Sigurdson 在设计流动装置方面提供了宝贵的投入。
Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
* Slides | ibidi | 80196 | 4 |
* Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
* 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
* 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |