In Vivo Imagerie des espèces réactives de l’oxygène dans un murin plaie modèle
Summary
Nous décrivons une non invasif en vivo imagerie protocole c’est facile et économique, utilisant L-012, un analogue de luminol chimiluminescence, de visualiser et de quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générés dans un modèle murin excisionnelle enroulé.
Abstract
La génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une caractéristique des processus inflammatoires, mais en excès, stress oxydatif est largement impliqué dans diverses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et le diabète. Nous avons déjà montré que la dysfonction du facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes)-comme 2 (Nrf2) / érythroïdes Kelch-comme culture cellulaire protéines 1 (Keap1) signalisation voie conduit à extrême déséquilibre ROS lors cutanée la cicatrisation chez les diabétiques. Étant donné que les niveaux ROS sont un indicateur important de la progression de la cicatrisation des plaies, des techniques de quantification précises et exactes sont précieux. Plusieurs essais in vitro pour mesurer des ROS dans les cellules et les tissus ont été décrites ; Toutefois, ils fournissent uniquement une seule mesure cumulative par échantillon. Plus récemment, ont permis le développement d’indicateurs de base de protéines et de modalités d’imagerie unique analyse spatio-temporelle. L-012 (C13H8ClN4NaO2) est un dérivé de luminol qui peut servir à la fois in vivo et in vitro par chimiluminescence détection de ROS générées par l’oxydase de NADPH. L-012 émet un signal plus fort que les autres sondes fluorescentes et s’est avéré être sensible et fiable pour la détection de ROS. L’applicabilité de laps de temps de L-012-facilité d’imagerie fournit des renseignements précieux sur les processus inflammatoires tout en réduisant la nécessité pour le sacrifice et dans l’ensemble le nombre d’animaux de l’étude. Nous décrivons ici un protocole utilisant L-012-facilité in vivo d’imagerie afin de quantifier le stress oxydatif dans un modèle de cicatrisation excisionnelle utilisant des souris diabétiques avec localement dysfonctionnel Nrf2/Keap1.
Introduction
Métabolites d’oxygène générés par le biais de processus inflammatoires contribuent à différentes cascades de signalisation ainsi qu’altération destructive des composants cellulaires1. Utilisant des techniques sensibles et spécifiques pour mesurer le ROS est essentiel pour l’étude des processus inflammatoires et de caractériser les effets du stress oxydatif. L’imagerie in vivo est précieux en raison de sa capacité à fournir des données dynamiques spatiales et temporelles dans les tissus vivants. L-012 est une sonde chimioluminescente synthétique qui est hautement sensible pour les anions superoxydes et produit une intensité lumineuse plus élevée que les autres sondes fluorescentes dans les cellules, de tissus et de sang total1,2,3, 4. il a été avec succès employé pour l’imagerie in vivo dans des modèles murins pour étudier plusieurs maladies inflammatoires, y compris l’arthrite et la colite5,6. Il n’a pas encore devant être utilisés dans une modèle de cicatrisation cutanée établie. Mesure de ROS généré est également pertinent évaluer la progression de la cicatrisation des plaies dans des conditions différentes. La sensibilité et le caractère non invasif de cette méthode en fait une technique prometteuse pour étudier la cicatrisation dans les modèles murins.
Nrf2 est un facteur déterminant de la réponse de l’antioxydant et un facteur de transcription avec une spécificité pour l’élément de réponse antioxydante (ARE) commun pour les régions promotrices de plusieurs d’enzymes antioxydantes8. En l’absence de stress oxydatif, Nrf2 est séquestré dans le cytoplasme par Keap1, ce qui provoque par la suite son ubiquitination et la dégradation. Déséquilibre de la voie Nrf2/Keap1 a été impliquée dans l’homéostasie redox inapproprié et cicatrisation retardée dans le cadre d’une augmentation du stress oxydatif,9. Nous avons déjà montré que la suppression de Keap1 stimule l’augmentation de l’activité Nrf2 et favorise des plaies de sauvetage de la guérison des plaies cutanées pathologiques chez les diabétiques9.
Nous décrivons ici un protocole qui utilise L-012 a contribué bioluminescence d’imagerie pour mesurer les concentrations ROS dans un modèle de guérison excisionnelle plaie cutanée, ce qui est essentiel pour mettre en évidence l’association entre les BR et la cicatrisation des plaies. Cette technique montre des changements en temps réel fardeau oxydant dans les plaies et de la périphérie immédiate. En outre, cette méthode permet pour une évaluation rapide des interventions et des mécanismes de cette manipulation de redox affect. Ici, nous utilisons un modèle de knockdown Keap1 pour la restauration de l’homéostasie redox pour évaluer l’applicabilité de notre stratégie. Parce que notre technique est non invasive et blessures sont intacts, le même animal peut être utilisé pour approfondir les analyses confirmatoires sur la base de lysats histologie ou de la cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques courantes de mesure de ROS ont été limités par des protocoles complexes nécessitant une extraction de tissu ou de la même façon des techniques invasives. Ces dernières années, les mesures du stress oxydatif ont été signalés sur la base de modalités d’imagerie innovantes, permettant ainsi à des évaluations spatio-temporelles9,10,11. L-012 présente plusieurs avantages comme une sonde chimioluminesce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au noyau d’imagerie préclinique à l’école de médecine de l’Université de New York, avec remerciements à Orlando Aristizabal et Youssef Zaim Wadghiri. Le noyau est une ressource partagée, partiellement pris en charge par la 5P30CA016087 Laura et Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI et ingénierie biomédicale Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Ce travail a été soutenu par l’American Diabetes Association « Voie à arrêter le diabète » à D.C. [numéro de licence 1-16-ACE-08] et le NYU appliqué recherche Fonds d’appui à P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
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