نقدم هنا بروتوكولا لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم وتحليل لدولته الأيضية. تقييم الشخصية الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية يمكن أن تساعد على أفضل وصف طلب الخلايا الأولية ويمكن أن تؤدي إلى الطب أكثر تخصيصاً.
شرط الأيضية للخلايا السرطانية يمكن أن تؤثر سلبا على فعالية العلاج والبقاء على قيد الحياة. في الوقت الحاضر، يتم اختبار الصيدلية استهداف الأيضية في أنواع عديدة من الأورام. وهكذا، وصف سرطان الخلية الأيضي الإعداد أمر لا مفر منه بغية استهداف المسار الصحيح لتحسين الحصيلة العامة للمرضى. ولسوء الحظ، في معظم حالات السرطان، الخلايا الخبيثة يصعب جداً الحصول على أرقام أعلى وخزعة النسيج مطلوب. سرطان الدم استثناء، حيث يمكن أن يكون عدد كاف من الخلايا ليوكيميك المعزولة من نخاع العظام. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم والتحليل اللاحق لدولته الأيضية استخدام محلل الجريان خارج الخلية. يتم عزل الخلايا ليوكيميك بالتدرج الكثافة، التي لا تؤثر على قدرتها على البقاء. الخطوة زراعة يساعدهم على تجديد، وبالتالي فالدولة الأيضية قياس حالة الخلايا في ظروف مثلى. يسمح هذا البروتوكول لتحقيق نتائج متسقة وموحدة جيدا، والتي يمكن أن تستخدم لعلاج شخصية.
التشكيل الجانبي الأيض واحدة من الخصائص الرئيسية للخلايا والاستقلاب غيرت تعتبر الآن واحدة من السمات المميزة للسرطان1،،من23. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التغييرات في إعداد التمثيل الغذائي في علاج السرطان باستهداف ممرات توصيل الإشارات أو الآلات الانزيمية من سرطان خلايا4،،من56. مع العلم نزعة الأيضية للخلايا السرطانية وبالتالي هي ميزة ويمكن أن تساعد في تحسين العلاج الحالي.
وهناك ير طرق القائمة بالفعل التي يمكن تقييم النشاط الأيضي للخلايا في الثقافة. فيما يتعلق بتحلل، امتصاص الجلوكوز يمكن أن تقاس بوصفها المشعة، باستخدام 2-نبدج (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) أو مستويات لاكتات خارج الخلية تقاس انزيماتيكالي7،8. معدل أكسدة الأحماض الدهنية معلمة الأيضية أخرى تقاس بنظير المسمى بالميتاتي،من910. معدل استهلاك الأكسجين أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتحديد النشاط الميتوكوندريا في الخلايا11،12، جنبا إلى جنب مع غشاء الميتوكوندريا المحتملة التقييم13،14، (الادينوسين ATP/ADP 5 ‘5’-ثلاثي/الادينوسين-diphosphate) نسبة قياس15 أو مجموعة داخل الخلية ATP قياس16. إشارات المسارات المعروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي يمكن أن تحددها كوانتيفيكيشنز البروتين ويمكن تحسين فهم القياسات الأيضية17،،من18إلى19.
بيد أن جميع هذه الأساليب قياس واحد فقط، أو في أفضل سيناريو، عدد قليل من المعالم الأيضي في إحدى عينة في وقت واحد. الأهم من ذلك، يمكن قياس المتزامن لمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (أكار) بتحليل الجريان خارج الخلية، على سبيل المثال، “فرس البحر XFp محلل”. التعرف الضوئي على الحروف مؤشر على التنفس المتقدرية وعكر هو أساسا نتيجة لتحلل (لا يمكن أن نتجاهل CO2 الإنتاج ربما رفع عكر الخلايا مع النشاط الفسفرة عالية)20. حتى الآن، وقد درسنا مختلف أنواع الخلايا استخدام هذه المحلﻻت21،،من2223.
هنا نحن تصف البروتوكول لتحليل تدفق خارج الخلية من الانفجارات الأولية (خلايا اللوكيميا المستمدة من المرحلة غير ناضجة المكونة للدم) من مرضى اللوكيميا. أفضل معرفتنا، بروتوكول معين للانفجارات الأولية ليست متاحة بعد.
يسمح البروتوكول المذكور أعلاه لقياس النشاط الأيضي المقررة حسب القيم التعرف الضوئي على الحروف وعكر في انفجارات ليوكيميك الأولية المستمدة من المرضى المصابين بسرطان الدم الليمفاوي الحاد (الكل) أو سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ميزة قياس استخدام محلل الجريان خارج الخلية أنه ي?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر مراكز أمراض الدم طب الأطفال التشيكية. وكان هذا العمل يدعم “منحة من وزارة الصحة” (NV15-28848A)، حسب وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية، و “جامعة مستشفى موتول”، براغ، الجمهورية التشيكية 00064203 ووزارة التربية والتعليم والشباب و “الرياضة نبو” nr. LO1604.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |