Здесь мы представляем на основе Люцифераза биосенсора для количественного определения активности протеинкиназы большие опухолевые супрессоры (лат)-Центральный киназы в бегемота, сигнальный путь. Этот биодатчик имеет разнообразные применения в базовых и трансляционного исследования, направленные на расследование Бегемот путь регуляторы в пробирке и в естественных условиях.
Бегемот, сигнальный путь является регулятором сохраняется размер органа и важную роль в биологии развития и рака. Из-за технических проблем по-прежнему трудно оценить деятельность этой сигнальный путь и интерпретировать его в биологическом контексте. В существующей литературе по большие опухолевые супрессоры (лат) опирается на методы, которые носят качественный характер и не может легко быть увеличен для скрининга. Недавно мы разработали на основе биолюминесценции биосенсора для мониторинга активности протеинкиназы ЛАТОВ а основного компонента Каскад киназы Бегемот. Здесь мы описываем процедуры как это биосенсор ЛАТОВ (ЛАТОВ-BS) может использоваться для характеристики Бегемот путь регуляторы. Во-первых мы предоставляем подробный протокол для расследования эффект гиперэкспрессия белка кандидата (например, VEGFR2) на активность ЛАТОВ, используя ЛАТОВ-BS. Затем мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для небольших киназы ингибитора экрана. Этот протокол реально может быть увеличен для выполнения больших экранов, которые несомненно будут определены новые регуляторы Бегемот пути.
Бегемот, сигнальные пути была впервые выявлена у дрозофилы как Роман регулятор роста клеток и животных размер1,2. С момента ее первоначального открытия, монтаж доказательства убедительно показал, что бегемот путь играет важнейшую роль в развитии (например, раннего эмбрионального развития, орган управления размер и трехмерные [3-D] Морфология), опухолей () например, развитие опухоли, метастазы, ангиогенез, иммунных уклонение, геномной нестабильности, реакции на стресс и лекарственной устойчивости) и ткани гомеостаза (например, обновление стволовых клеток и дифференциации и регенерации тканей после травмы) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Бегемот сигнализации это часто dysregulated в различных раков7,8,9,10,,1112. Таким образом изучение функций Бегемот пути в биологии рака и терапии и регенеративной медицины стал одним из горячих районах в биомедицинских исследований.
В краткое, Бегемот пути, после активации регуляторами вверх по течению (например, контакт ячеек, биогенного стресса и внеклеточного матрикса [ECM]), киназы Серин/треонин (S/T) MST1/2 (MST; млекопитающих гомолог дрозофилы бегемота) фосфорилировать/активировать адаптер белки hMOB1 и WW45, а также киназы LATS1/2 (в ЛАТАХ), которые, впоследствии, фосфорилировать транскрипционный анализ совместного активатор YAP и его paralog таз на сохранение HX(H/R/K)XX(S/T) (H, гистидина; R, аргинин; K, лизин; S, серина; T, треонин; X, любой аминокислоты) мотивы, включая яп-S127 и таз-S8911,12. S127 фосфорилированных YAP (яп pS127) и S89-фосфорилированных таз (таз pS89) деградировавших в результате ubiquitination или привязку цитоплазматического белка 14-3-3 и лишены возможности взаимодействия с TEAD1-4 транскрипционные факторы в ядре для transactivate вниз по течению генов, участвующих в пролиферации и апоптоза (рис. 1). Несмотря на огромный интерес к Бегемот пути, существует несколько инструментов для измерения Бегемот сигналов и те, которые были исторически ограничивается журналистами транскрипционный анализ вывода YAP/таз/TEAD. Действительно, до недавнего времени, были не инструменты для измерения динамики и деятельности Бегемот сигнализации компоненты в количественных, реального времени, высокой пропускной способности и неинвазивным способом в пробирке и в естественных условиях.
Учитывая наши новые понимания роли белок белковых взаимодействий в физиологии и патологии, есть большой интерес к разработке инструментов, которые могут быть использованы для изучения этих взаимодействий в количественных и реального времени13, 14,,1516. Действительно достигнут значительный прогресс в развитии био аналитических стратегий, в том числе (Y2H) 2 гибрида дрождей17, поверхностного плазмон резонанс (СРП)18и Фёрстер резонанс энергии передачи (ЛАДА)19 анализов, для оценки взаимодействия протеин протеина. Однако эти подходы нести ограничение требует оптимизации репортер ориентации, таким образом, что многие конструкции должен быть испытан найти эффективный один. Кроме того эти подходы также имеют сравнительно низкое соотношение сигнал шум, таким образом, что взыскательных правда позитивных сигналов может быть сложным.
Белка дополнения анализов были разработаны, чтобы преодолеть эти ограничения. Первое поколение белка дополнения анализов был основан на Сплит многоцветной флуоресцирование белками и не может решить вышеупомянутые ограничения20. Многоцветная флуоресценции белков состоят из одного домена, что делает его трудно разделить их на две отдельные фрагменты стабильной с низкого сродства и фоновый шум21. Впоследствии Светлячок Люцифераза была определена как новый кандидат для использования при разработке Сплит белка дополнения анализов. В этом подходе Светлячок Люцифераза делится на два фрагмента (Люцифераза [NLuc и CLuc] N- и C-терминала) с каждого фрагмента, сливается с целевого белка интереса. Если NLuc и CLuc принесены в близости при взаимодействии двух целевых белков, воссоздана Люцифераза активность и биолюминесцентных свет генерируется при наличии люциферин субстрата и СПС22. В 2001 году выполняя комбинаторной скрининг с использованием библиотеки, содержащие NLuc и CLuc фрагменты разрезать на различных сайтах и придает белков с различными компоновщики, Paulmurugan и Гамбхир Стэнфордского университета разработали оптимизированные Сплит Светлячок Люцифераза фрагмент при содействии взаимодополняемости системы для взаимодействий протеин23. В этой системе Светлячок Люцифераза разрезается на аминокислоты (aa) 398 сформировать NLuc и CLuc, которые прикреплены к два протеинов интереса, с использованием гибких компоновщика восьми глицин остатков и остатков два серина.
Используя аналогичный подход, мы недавно разработали новый ЛАТОВ-BS путем сплавления NLuc до 15 АА штата Яп, окружающие место фосфорилирование ЛАТОВ на S127 (YAP15) и CLuc с 14-3-3. Полнометражный YAP белка не использовался, чтобы избежать смешанных сигналов, столб-поступательные изменения других вышестоящих регуляторами штата Яп (например, фосфорилирование на других сайтах и ubiquitination). ЛАТ-BS, представленные здесь неинвазивно может контролировать Бегемот сигнализации деятельности как в пробирке в живых клетках и в естественных условиях в мышей20,24 (рис. 2). Здесь мы описываем подробный протокол для измерения ЛАТОВ киназы активность в пробирке с помощью ЛАТОВ-BS. Во-первых мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для исследовать эффект гиперэкспрессия белка на активность ЛАТОВ. Затем мы покажем, как биосенсор может использоваться для мониторинга активности Бегемот путь после лечения с агентами, регулирующие Бегемот путь. Этот протокол может использоваться для выявления и характеристики сигнальных путей или стимулы, регулирующие деятельность киназы ЛАТОВ.
В то время как Бегемот путь играет важную роль в различных биологических процессах, и регуляции Бегемот путь приводит к рака6, как Бегемот путь регулируется в ответ на различные стимулы полностью не поняты. Кроме того был не количественные, так и в реальном времени системы д…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана от грантов от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ #119325, 148629) и Канадский Фонд рака молочной железы (CBCF) для XY. TA поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии и стипендии выпускников Международного Онтарио. HJJVR поддерживается королевы Елизаветы II выпускников стипендии в области науки и техники.
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |