Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture
Summary
Souris génétiquement modifiées sont des modèles utiles pour l’étude des mécanismes du cancer de la prostate. Nous présentons ici un protocole en vue d’identifier et de disséquer les lobes de la prostate depuis un système urogénital de la souris, de différencier basé sur l’histologie et d’isoler et de culture primaire de cellules prostatiques in vitro comme sphéroïdes pour analyses en aval.
Abstract
Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) servent de modèles précliniques efficaces pour enquêter sur la plupart des types de cancers humains, y compris le cancer de la prostate (PCa). Comprendre l’anatomie et l’histologie de la prostate de souris est important pour l’utilisation efficace et bien qualifier ces modèles animaux. La prostate de souris a quatre paires distinctes des lobes, chacun avec leurs propres caractéristiques. Cet article illustre la bonne méthode de dissection et l’identification des lobes de la prostate souris pour l’analyse de la maladie. Après dissection, les cellules de la prostate peuvent être davantage cultivés in vitro pour interprétation mécaniste. Depuis la souris la prostate cellules primaires ont tendance à perdre leurs caractéristiques normales lorsque cultivées in vitro, nous présentons ici une méthode pour isoler les cellules et leur culture en tant que cultures 3D sphéroïde, qui est efficace pour préserver la physiologique caractéristiques des cellules. Ces cultures 3D peuvent être utilisés pour analyser la morphologie des cellules et des niveaux de comportement dans des conditions physiologiques près, enquêter sur modifié et localisations des protéines clés et voies impliquées dans le développement et la progression d’une maladie et en regardant réponses aux traitements médicamenteux.
Introduction
La communauté scientifique a tenté d’élucider le mécanisme complex de développement de cancer chez l’homme depuis des décennies. Considérant que l’identification des acteurs potentiels et des cibles de médicaments commence avec les cellules de patients et les études sur les tissus, l’application translationnelle de telles conclusions souvent nécessite l’utilisation de modèles animaux précliniques. L’utilisation de souris génétiquement modifiées (edged) des modèles de cancers humains modèle a régulièrement augmenté depuis la mise en place de la souris modèles de humaine Cancers Consortium (NCI-MMHCC), un comité qui a cherché à décrire et d’unifier les caractéristiques du cancer de la souris modèles de scientifiques dans le monde1,2. Modèles murins combler le besoin d’études mécanistes dans des études précliniques de la plupart des types de cancer, pour comprendre le développement, la progression, la réponse aux traitements et acquis de résistance3.
Cancer de la prostate est le cancer plus fréquents chez les hommes, qui affectent plus 160 000 hommes chaque année4. Les formes agressives de la maladie réclamer des dizaines de milliers de vies chaque année. Toutefois, le mécanisme de la progression de la maladie est encore mal compris. Cela se traduit par un sérieux manque d’options de traitement efficace pour le cancer de la prostate avancé ou métastatique, comme en témoigne le taux élevé de mortalité dans les patients de cancer de la prostate avancé4. Par conséquent, il y a un besoin croissant de modèles précliniques étudier le cancer de la prostate. Toutefois, en raison des différences inhérentes entre la souris et l’homme la prostate, modélisation du cancer de la prostate en edged n’a pas gagné popularité jusqu’à ce que le système de Classification de Bar Harbor a été introduit en 2004, qui décrit les changements histopathologiques chez la souris prostate lors de la manipulation génétique, identification des modifications néoplasiques et leur relation aux étapes de la progression du cancer dans les humains5. Une caractéristique importante de la prostate de souris qui doit être prise en considération pendant ses études à n’importe quel modèle GEMM la prostate est la présence de quatre paires distinctes des lobes : antérieure, latérale, ventrale et dorsale. Les lobes présentent des différences significatives dans l’histopathologie et gene expression modèle6. Modèle d’expression des protéines probasin peut varier entre les lobes chez les jeunes souris après puberté7, qui doit être considérée puisque des modèles axés sur les Cre GEMM visent principalement à l’aide d’un promoteur axée sur le probasin appelé Pb-Cre47. Les différences spatiales et temporelles qui en résulte dans l’expression de Cre souvent conduisent à des différences dans les chronologies d’initiation et progression tumorale ainsi que les différences dans les modifications néoplasiques entre les lobes. Par conséquent, il est important de tenir compte de ces différences tout en étudiant le développement de tumeurs de la prostate edged, et les lobes individuels peuvent doivent être évalués séparément pour obtenir des résultats reproductibles. La première partie de cet article décrit les méthodes appropriées pour disséquer une prostate de souris, identifier et séparer chaque lobe et reconnaître les différences histologiques entre les lobes.
Si l’analyse de la croissance tumorale et l’histopathologie peut fournir des renseignements précieux dans le développement de la tumeur, ils ne fournissent pas beaucoup d’informations sur les mécanismes moléculaires. Pour étudier le mécanisme de développement de la tumeur et la progression, il est souvent utile d’analyser la tumeur des cellules in vitro. Plusieurs méthodes ont été proposées au cours des années qui impliquent des cultures de ces cellules, y compris les cultures en suspension, cultures 3D8 et récemment, 2D ordinaire cultures9. Considérant que la plupart de ces méthodes aboutissent à des taux de survie et la prolifération cellulaire bonne, les cultures 3D fournissent un environnement plus proche des conditions physiologiques. Dans les cultures 3D ou sphéroïde dans une membrane basale de la matrice extracellulaire (ECM), les cellules luminales complètement différenciées ont généralement des taux de survie très faible ; Cependant, les cellules basales et intermédiaires (pour la plupart des cellules souches) sont capables de se propager et produisent des grappes de cellules appelées sphéroïdes10. Cela le rend approprié pour une étude sur le cancer puisque les cancers épithéliaux sont censés provenir de cellules souches (populairement connus comme les cellules souches cancéreuses)11. La deuxième partie du présent protocole décrit une méthode pour cultiver les cellules de la prostate de souris dans les cultures 3D. Les sphères qui en résulte peuvent être utilisés pour plusieurs types d’analyses en aval, y compris l’étude de la morphologie organoïde et le comportement de cellules vivantes, imagerie, immunofluorescence souillant pour différentes protéines et l’étude des réponses à la chimiothérapie traitements.
Dans l’ensemble, le but du présent protocole est de définir des méthodes optimales pour l’utilisation de modèles de souris dans le cancer de la prostate en décrivant les techniques d’anatomie et de dissection de la prostate de la souris et le traitement du tissu pour les cultures de sphéroïde et in vitro d’analyse .
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit les méthodes pour l’identification des lobes individuels et dissection de la prostate de souris. Également décrit est le protocole pour la culture des cellules de la prostate de souris dans une culture 3D pour l’analyse in vitro .
Une étape cruciale dans le protocole de la dissection est récolte l’UGS ensemble hors de la souris (1) et séparer les organes individuels sous un microscope à dissection. Le tissu prostatique est très petit et entouré par l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention du National Cancer Institute, R01CA161018 de LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
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