Здесь представлен протокол для анализа средне высокой производительностью событий фосфорилирование белков на клеточном уровне. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.
Сигнализации аберрантных клеток играет центральную роль в развитии рака и прогрессии. Наиболее Роман целевой терапии действительно направлены на белки и функций белков, и клетки сигнализации аберраций поэтому может служить в качестве биомаркеров для обозначения персонализированные лечения. В отличие от анализа ДНК и РНК изменения в активности белка может более эффективно оценить механизмы лекарственной чувствительности и сопротивления. Фосфоресцентный проточной цитометрии является мощным средством, что меры события фосфорилирование белков на клеточном уровне, важной особенностью, которая отличает этот метод от других подходов, основанных на антитела. Этот метод позволяет одновременный анализ нескольких сигнальных белков. В сочетании с люминесцентные клеток штриховое кодирование большие наборы данных средне высокой производительностью могут быть приобретены по стандартным цитометр оборудования в короткие сроки. Фосфоресцентный проточной цитометрии имеет приложений как в исследованиях по вопросам базовой биологии, так и в клинических исследованиях, в том числе сигнального анализа, обнаружения биомаркеров и оценки фармакодинамика. Здесь для анализа потока фосфористой очищенный периферической крови мононуклеаров, с использованием клеток хронического лимфолейкоза в качестве примера приводится подробный экспериментальный протокол.
Фосфоресцентный проточной цитометрии используется для анализа уровня фосфорилирование белка одноклеточных разрешением. Общая цель метода является сопоставление клеточных сигналов шаблоны при определенных условиях. Эксплуатируя многопараметрических потенциала проточной цитометрии, несколько сигнальных путей может быть одновременно исследовано в разных подмножеств населения гетерогенных клеток периферической крови. Эти черты предлагают преимущества перед другими технологиями на основе антител, иммуногистохимия, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), блок протеина и обратной фазы белка массив (RPPA)1. Фосфоресцентный проточной цитометрии может сочетаться с люминесцентные клеток штриховое кодирование (FCB), что означает, что образцы отдельные клетки помечены с уникальными подписями флуоресцентных красителей, так что они могут быть смешаны вместе, витражи и проанализированы как единого образца2. Это уменьшает потребление антител, повышает надежность данных через сочетание управления и обработанные образцы и повышает скорость приобретения. Численностью населения FCB затем можно разделить на меньшие образцов и окрашивали до 35 различных фосфо специфические антитела, в зависимости от количества исходного материала. Таким образом, большие профилирования эксперименты выполняется с стандартным цитометр оборудования. Фосфоресцентный проточной цитометрии был применен к профилю, сигнальные пути в пациентов образцов из нескольких гематологических рака, включая хронического лимфолейкоза (ХЛЛ)3,4,5, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) 6 и неходжкинских лимфом7. Таким образом, фосфористой проточной цитометрии является мощный подход к характеризуют сигнализации аберраций, выявления и проверки биомаркеров и оценить фармакодинамика.
Здесь оптимизированный протокол для анализа ХЛЛ пациентов образцов подачей cytometry фосфористой предоставляется (рис. 1A). Приведены примеры базальной сигнализации характеристика, стимуляции рецепторов клеток anti-IgM/B и наркотиков возмущений. Приводится подробное описание FCB матрицы. Протокол может быть легко адаптирована для других типов клеток подвеска.
Фосфоресцентный проточной цитометрии – это мощный метод для измерения уровней фосфорилирование белков в одиночных клетках. Поскольку этот метод опирается на окрашивание с антителами, фосфористой проточной цитометрии ограничено наличием антител. Кроме того для того чтобы получить н?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа проводилась в лаборатории профессора Kjetil Taskén и была поддержана норвежского общества рака и Стифтельсен Кристиан Gerhard Jebsen. Йоханнес Ландскрон и Марианна Enger признал критических чтении рукописи.
RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
Falcon tubes | Defined by user | ||
Eppendorf tubes | Defined by user | ||
96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antigen | |||
AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |