여기, 우리가 어떻게 다른 환경 변수를 평가 하는 혐 기성 전체 셀 미생물 바이오 센서를 사용 하는 프로토콜을 제시 무산 소 환경에서 박테리아를 Hg와 Cd의 bioavailability에 영향을 미칠.
미생물을 수은 (Hg) bioavailability 식품 웹에서 독성 Hg biomagnification에 중요 한 단계 이다. 카드뮴 (Cd) 변환 및 박테리아 bioavailability 주식 작물에 축적 됩니다 금액을 제어 합니다. 이러한 금속의 bioavailability 솔루션, 하지만 Hg 독성 monomethylmercury (MeHg)에 갠 및 Cd는 rhizosphere에서 지속 무산 소 조건에서 특히 그들의 종 형성에 따라 달라 집니다. 전체 셀 미생물 바이오 센서는 금속은 cytosol 들어가고 따라서 유용한 도구 금속 bioavailability를 평가 하는 때 같지는 신호를 줄. 불행히도, 대부분 바이오 센 싱 노력 까지는 산소가 없을 경우에는 함수에 기존 기자 단백질의 제한 된 능력으로 인해 oxic 환경 제한 되어 있다. 이 연구에서 우리는 우리의 노력을 개발 하 고 전체 셀 바이오 센서 분석 결과 작동 수 있는 최적화 anaerobically 준 진짜 시간에서 및 시간 무산 소 조건 하에서 금속을 감지할 수를 제시. 우리는 어떻게는 바이오 센서 평가 어떻게 화학 변수 관련 금속 영향의 환경 자전거 그들의 bioavailability을 도울 수 설명 합니다. (1) Hg를 준비 하는 방법을 포함 하는 다음 프로토콜 및 무산 소 조건, (2) Cd 표준 산소, (3) 디자인의 부재에 바이오 센서를 준비 하 고 Hg 또는 Cd bioavailability, 및 (4)에 미치는 일련의 변수를 확인 하는 실험을 실행 계량 하려면 바이오 센서 데이터를 해석. 우리는 바이오 센서의 선형 범위를 표시 하 고 금속을 유도할 수 있는 및 제정 종자를 이용 하 여 금속 bioavailability와 독성 사이 구별 하는 메서드의 기능을 보여 주는 예제를 제공 합니다.
수은 (Hg) 글로벌 오염 물질 이며 Hg 미생물 methylating에 그것의 bioavailability 음식 거미줄 인간에서 가능한 신경 효과 및 야생 동물1통해 자사의 biomagnification 향한 첫 번째 단계입니다. 그것은 현재 그 미생물 Hg 메 틸 화는 요구 하는 세포내 과정 생각: i) Hg bioavailable2,3,,45,6,7 수의 종 ii) Hg8,,910methylating의 순수 수 셀. 하지만 유기 체, 카드뮴 (Cd) bioaccumulates foodwebs에 biomagnifies 하지 않으며 사람과 환경11일반적으로 급성 노출 시키는 산업 및 상업 공정에 널리 사용 됩니다. 미생물 핵심 역활을 여러 환경에서 Hg의 운명에, 비록 Cd 지구 화학 및 ecotoxicology에 대부분의 연구는 미생물 진핵생물12에 초점. 농업 작물 (예를 들어, 쌀)의 소비는 카드뮴;에 직접 노출의 주요 소스 이 경우에 rhizosphere의 미생물을 Cd의 bioavailability 직접 금액을 영향 식물13누적 될 수 있습니다.
Hg 전송 경로 복잡 하 고 가능 하 게 활성 전송 단계14를 포함 한다. 전송 관련 최근 작품 HgII 는 Zn을 사용 하 여 제안II 또는 미네소타II 전송7,15,,1617. 반면 CdII 실수로 수송 가설 (특히 미네소타II 또는 ZnII) divalent 금속 전송 경로 통해 cytosol로 CdII 의 메커니즘 셀 유지 하는 내부 전송 투기, 그리고 더 Cd 전용 전송 경로 확인 된13,18되었습니다. 관련 된 전송기의 자연에 3 개의 기계적 요인 궁극적으로 셀 입력 금속 수 결정: 솔루션2,6,15, i) 금속 종 형성 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii)는 세포 막17,,2425,26,27,28,29의 biophysiochemical 속성 ,,3031및 iii) 전송 사이트7,32액세스할 수 금속에 대 한 능력. Cd 및 Hg 또는 되지 않습니다 때문에 그들의 높은 선호도 대 한 해산 유기 물질 (DOM), 미생물 생리학 관련 조건 하에서 자유로운 이온으로 존재 하는 것 (예를 들어, EDTA), 오염 물질을 킬레이트 화 황 moieties33, 감소 34,35 (CdII 는 무료 이온 또는 양식 이온-쌍이이 ligands의 휴무에서 존재할 수 있습니다). 어떻게 이러한 금속 종은 환경에 그들의 운명에 관련 된 조건 bioavailable 결정에 효율적인 방법의 부족이 이다. 예를 들어, Hg 혐 기성 조건14, 아래 갠 고 카드뮴과 Hg는 부드러운 금속 (또는 클래스 B 양이온), 감소 된 유황 그룹의 무결성을 유지 하는 조건 하에서 그들의 종 분화를 조사 요구.
미생물 바이오 센서는 금속,이 경우 Hg 또는 Cd의 세포내 농도에 대응 가능한 신호를 방출 하는 세균성 세포 이다. 이와 같이, 그들은 이상적인 도구 노출 조건에 대 한 신중 하 게 제어 됩니다 어떻게 금속 입력 셀36를 이해 하. Hg 바이오 센서는 일반적으로 메 르의 규제 회로 사이 유전자 융해를 포함-오 페론 (연산자 및 발기인으로는 오 페론의 전사 레 귤 레이 터 MerRas에 대 한 인코딩을 포함 하 여 유전자), 및 유전자 보고 (예: 럭 스, gfp, 락 유전자). 수은 세포질에 존재 하는 때 그것 MerR, 후속 신호 생산19,37고 보고 유전자의 녹음 방송에 있는 결과에 바인딩합니다. 특정 Cd 바이오 센서는 일반적으로 cadC를 사용 하 여 설계 cadAC, zntA 또는 zntR 인코딩 전사 레 귤 레이 터38, 하지만 MerR Cd5, 아직 같지는 선호도 지적 가치가 있다. 대부분의 에어로빅 제한 일반적으로 사용 또는 형광 발광 기자 단백질, 최근 미생물 바이오 센서는 생물학적 무산 소 조건 하에서 금속에 대 한 통찰력을 제공 하 없는 남아 때까지. 이것은 금속 bioavailability의 혐 기성 검출 매우 어려운 조건의 범위에 걸쳐 redox 민감한 ligands (예를 들어, 황화와 thiols)4, 의 특히 환경 그들의 운명에 관련 5 , 39.
완화의 방법론 장애물 라이브 이미징 Drepper 외. 산소의 부재에 (2007) 플 라빈 기반 형광 단백질 (FbFp)를 개발, P. putida에서 SB2 단백질의 가벼운 산소 전압 도메인에 따라. 이 단백질 가족은 산소40의 부재에서 형광을 수 있다. Drepper 외의 일에 건물, 연구소 설계 Hg bioavailability oxic 무산 소 조건 하에서 및 넓은 범위의 염 분 17의 연구에 대 한 허용 하는 혐 기성 바이오 센서. 현재 신문에서 우리 준비는 바이오 센서를 사용 하 여 환경 변수 Hg 또는 Cd bioavailability에 영향을 테스트 하는 방법을 설명 합니다. 우리가 HgII는 바이오 센서 개발, 우리는 바이오 센서는 또한 공동 환경에서 발생 하는 여러 스트레스 응답할 사실에 독자의 관심을 끌기 위해 수단으로 CdII 와 실험을 수행 하기로 행렬; 이 경우 CdII MerR5transcriptional 레 귤 레이 터에 바인딩할 알려져 있기 때문에 조사 되었다. 여기, 우리 대표 교정 및 중 금속 기준 기능 선형 범위를 보여줍니다. 우리는 또한 줄 예를 들어 바이오 센서의 결과 결정적인 (MgII 와II Hg bioavailability에 Mn) 및 불확실 (ZnII Hg bioavailability에).
미생물 바이오 센서는 금속 미생물와 상호 작용 하는 메커니즘을 식별 하기 위해 유용한 도구입니다. 여기, 우리 anaerobically Hg를 계량 수 있습니다 방법을 설명II 및 CdII bioavailability 그람 음성 호스트 셀 (대장균) 하 게 같지는 결과 몇 시간. 이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 강력한 바인딩 ligands 또는 금속 강수량으로 이어질 수 있습니다 구성 요소를 피 함으로써 금속 종 형성의 한 광범위 한 제어 노출 매체에 수는입니다. 그러나 금속 종 형성 모델 되었고 PHREEQC17를 사용 하 여이 노출 매체에 테스트 다른 금속 종 형성 소프트웨어를 배포할 수 있습니다. 아니 추가 ligands, Hg speciation 97% Hg(OH)2 와 3 %Hg (NH3)22 +, 있을 것으로 예상 된다 경우 Cd speciation 됩니다 59 %Cd-β-Glycerophosphate, 25 %Cd2 +및 16% CdSO4로 제시. 단순한 열역학적 모델링 소프트웨어를 사용 하 여 사용자 수 노출 미디어 디자인과 관심의 금속의 생체 이용률에 대 한 테스트. 또한, 바이오 센서 호스트 셀 (대장균 NEB5α) 끝났습니다 가능한 다양 한 pH (5-8.5)와 NaCl 농도 (0-0.55 M)17.
Hg 메 틸은 혐 기성 과정, 그리고이 연구에 제시 된 프로토콜 산소, 금속 bioavailability에 혐 기성 물질 대사의 더 정확한 설명에 대 한 허용에 대 한 요구 사항이 적용 되지 않습니다. 이것은 중요 하기 때문에 산소의 존재 유전자 식 프로필48,49 를 따라서, 잠재적인 전송 경로; 따라서이 메서드는 현재 exising 에어로빅 대안 이점을 선물 한다. 여기에 제시 된 바이오 센 싱 구조 수은 메 틸 화 (예를 들어, Geobacter, Desulfovibrio), 하지만 아마도 더 많은 관련이 있을 수 있습니다 다른 혐 기성 호스트와 함께 사용 될 대장균보다 적게 온순한. 여기에 제시 된 접근의 한 현재 한계는 탐지의 우리의 한계는 하지 아직 수준에 도달 오후, 기존의 에어로빅 시스템4,,1937반대입니다. 그러나 그것은이 낮은 검출 한계를 달성 하는 중요 한 몇 가지 단계를 수행 해야44: 나) 리간드 추가 Hg 솔루션에 남아 (Hg 돌이킬 수 없는 바인딩 될 것입니다 미생물 세포 벽에 흡착 되지 않습니다 있도록 필요 세포 표면 thiols의 bioavailability25,27; 방지를 그림 3A에서 Hg에 대 한 임계값 응답 참조) ii) 셀 밀도, 또는 iii에 대 한 수정) 메 르의 수송 단백질을 포함 하도록 유전자 구조를 수정-오 페론 (즉 merT 와 merP), 증가 Hg 플럭스 셀50,51내부. 이러한 수정, Hg의 낮은 농도 검출에 유용 하지만 반드시 이상적인 환경 관련 상황을 평가할 때 것. 반면 이전 카드뮴 바이오 센서는 주로 원리의 “증거”로 존재, 그들은 speciation bioavailability41,42, 의 역할을 평가 하기 위해 조사를 허용 하지 않는 복잡 한 미디어에서 설계 되었다 43 , 44.
바이오 센서는 금속 종은 bioavailable 메커니즘을 결정 한 매우 유용한 도구입니다. 때문에 호스트 유기 체 Hg methylator 아니다는 어떻게 Hg 입력할 수 있습니다 그램 음성 박테리아와 확실 한 근거 하지 Hg methylators Hg를 취득 하는 방법에 대 한 모델을 개발 하는 것만 사용할 수 있습니다. 다른 방법 존재 이해의 결과 또는는 질량 균형 접근10,15,20,,4546의 사용으로 메 틸 화, 같은 Hg bioavailability를 결정 합니다. 그 말했다 하 고, 여기에 제시 하는 방법 가능한 셀에 준 실시간으로 bioavailability 데이터의 이점을 제공 합니다. 우리는 환경 매트릭스에서 총 Hg 또는 Cd 수준의 척도를이 메서드를 사용 권장 하지 않습니다. 36환경 금속 농도 결정 하기 위해 바이오 센서의 제안 된 사용에도 불구 하 고 많은 더 쉽게 사용할 수 있는 표준 방법을 ICP-MS, FAAS (Cd 분석)에 대 한 등 냉 증기 원자 흡수 분광학 (Hg에 대 한 사용할 수 있습니다. 분석)입니다. 그러나 바이오 센서는 수 있는 주어진된 환경 매트릭스에 강화 하거나 bioavailability; 방해 가능성이 있는지 확인 하는 데 사용 이것은 표준 추가 수행 하 여 달성.
노출 매체의 pH 변경 될 수 있습니다를 어디서 나 5와 8.5의 범위 내에서 적절 한 pKa와 버퍼의 대체 무료 산 MOPS 자유로운 산 (버퍼) 교환 제공 (목록을 참조 하십시오 적절 한 버퍼 (페 레이 외. (2015) 47) 노출 매체를 만들 때 적절 한 pH에 코와 함께 조정. 또한, 메서드 Hg, Cd에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 전사 레 귤 레이 터를 사용 하 여 다른 금속을 확장할 수 있습니다.
Hg 또는 Cd bioavailability에 O2 와 포 등 다른 전자 수락자의 영향을 탐구 하는 노출 분석 결과 수정할 수 있습니다. 전자 수락자로 O2 와 포를 활용 하는 방법에 대 한 사소한 수정 요청 시 사용할 수 있습니다.
요약 우리가 다음 포인트를 강조 하 고 싶습니다: 나) 는 바이오 센서를 보정 하는 데 사용할 것입니다 이러한 Cd 또는 Hg 주식의 농도 2 단계에서 알려져 있습니다 필수적입니다. II) 노출 하루에 셀의 성장 0.6 (± 0.1)의 OD600 에서 중지 해야 합니다 하 고 그는 주의이 셀 밀도 보정은 셀 문화는 바이오 센서로 서 resuspending 때. III) 마지막으로, 그것은 중요 한 노출 매체 노출 날에 꼼꼼하게 만든. 프로토콜의 성공을 위해 동시에 (우회 하 성장 실패의 가능성) 여러 문화를 성장 하 고 성장 매체 (미디어 및 가능한 오염 metastability 우회)를 매주 만들어 해야 합니다. 또한 생물 복제 (여러 셀 문화)에 가변성 표현 신호 생산에 관해서 주목 한다. 형광 응답 문화에서 문화에 다를 수 있습니다, 비록 주어진 변수에 응답 형광 동향 수많은 생물 복제에 걸쳐 동일한 있어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 혐 기성 바이오 센서의 개발에 통찰력이 토론 Poulain 실험실의 잘 멤버로 두 익명 검토자의 의견을 감사 하 고 싶습니다. 온타리오 주 및 검색 부여에서 초기 연구원 수상 및 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다에서 A.J.P.는 가속기 보충이이 연구 자금.
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |