Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione
Summary
Qui presentiamo un protocollo di sequenziamento di nuova generazione per rRNA 16S che consente l’identificazione e la caratterizzazione delle comunità microbiche all’interno di vettori. Questo metodo prevede l’estrazione di DNA, amplificazione e codici a barre dei campioni mediante PCR, sequenziamento su una cella di flusso e la bioinformatica per abbinare i dati di sequenza filogenetica informazioni.
Abstract
Negli ultimi decenni, malattie trasmesse da vettori sono riemerse e ampliato a tassi, causando una notevole morbilità e mortalità in tutto il mondo in modo allarmante. Per la maggior parte di queste malattie, che richiedono lo sviluppo di strategie di mitigazione del romanzo malattia stanno difettando di vaccini efficaci e ampiamente disponibili. A tal fine, una strada promettente di controllo della malattia coinvolge il microbioma vettoriale, la comunità di microbi che abitano il vettore di targeting. Il microbioma vettore svolge un ruolo fondamentale nelle dinamiche di agente patogeno, e manipolazioni del microbioma hanno portato a vector ridotta trasmissione di abbondanza o di agenti patogeni per una manciata di malattie trasmesse da vettori. Tuttavia, tradurre questi risultati in applicazioni di controllo di malattia richiede una conoscenza approfondita dell’ecologia microbica di vettore, storicamente limitato dalla tecnologia insufficiente in questo campo. L’avvento di approcci di sequenziamento di nuova generazione ha permesso sequenza rapida, altamente parallelo di diverse comunità microbiche. Gene del rRNA 16S altamente conservata di targeting ha facilitato caratterizzazioni di microbi presenti all’interno di vettori sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentale. Questa tecnica comporta l’amplificazione del gene del rRNA 16S, codici a barre campione tramite PCR, caricamento campioni su una cella di flusso per il sequenziamento, e bioinformatica si avvicina per abbinare i dati di sequenza con informazioni filogenetiche. Specie o identificazione a livello di genere per un numero elevato di repliche in genere può essere raggiunto attraverso questo approccio, aggirando così le sfide di rilevamento basso, ad alta risoluzione e uscita da coltura tradizionale, microscopia o macchiatura istologica tecniche. Pertanto, questo metodo è particolarmente adatto per la caratterizzazione di microbi di vettore in condizioni diverse, ma attualmente non può fornire informazioni sulla funzione microbica, posizione all’interno del vettore, o risposta al trattamento antibiotico. Nel complesso, la generazione 16S è una tecnica potente per comprendere meglio l’identità e il ruolo dei microbi di vettore nelle dinamiche di malattia.
Introduction
La rinascita e la diffusione di malattie trasmesse da vettori negli ultimi decenni una minaccia seria alla salute globale di umani e animali selvatici. Vaccini efficaci sono carenti per la maggior parte di queste malattie, e gli sforzi di controllo sono ostacolati dalla natura biologica complessa di vettori e interazioni ospite-vettore. Comprensione del ruolo delle interazioni microbiche all’interno di un vettore nella trasmissione dell’agente patogeno può consentire lo sviluppo di nuove strategie che eludere queste sfide. In particolare, interazioni tra vettore associato microbiche commensali, simbionti e patogeni, indicati come il microbioma, possono avere conseguenze importanti per la trasmissione di agenti patogeni. Prove schiaccianti ora supporta questa asserzione, con esempi che dimostrano un collegamento tra il vettore microbiome e competenza per malattie come la malaria, virus di Zika e malattia di Lyme1,2,3. Tuttavia, tradurre questi risultati in strategie per il controllo della malattia richiede una comprensione molto più dettagliata della struttura, funzione e origine del vettore microbiomi. Identificazione e caratterizzazione della comunità microbica vettoriale sotto diverse condizioni ecologiche e sperimentali costituiscono un importante percorso in avanti in questo campo.
Qui è disponibile una procedura per identificare i residenti microbici di un vettore patogeno utilizzando il Western battito nero-fornito di gambe, pacificus di Ixodes, una specie di vettore dell’agente patogeno la malattia di Lyme Borrelia burgdorferi. Mentre le zecche del porto più tipi di agenti patogeni umani rispetto a qualsiasi altri artropodi, relativamente piccolo è conosciuto circa l’ecologia biologia e comunità di tick microbiomi4. È evidente che le zecche harbor una gamma diversificata di virus, batteri, funghi e protozoi sono commensali, endosimbionti e residenti microbica transitoria5,4. Lavoro precedente ha dimostrato forti variazioni in Ixodes microbiomi associati di geografia, specie, sesso, fase di vita e di farine di sangue fonte6,7,8. Tuttavia, i meccanismi alla base di questa variazione rimangono sconosciuti e garantiscono che più dettagliate indagini sull’origine e l’assemblaggio di queste comunità microbiche. Le zecche possono acquisire i microbi attraverso trasmissione verticale, contatto con padroni di casa e l’assorbimento dall’ambiente attraverso gli spiracoli, bocca e poro anale9. Comprendere i fattori che determinano la formazione iniziale e lo sviluppo del microbioma tick, in particolare il contributo relativo di trasmissione verticale e ambientale, è importante per comprendere i modelli naturali e le variazioni in segno di graduazione microbioma diversità e come queste comunità interagiscono durante la trasmissione di agenti patogeni, con possibili applicazioni per controllo di malattia o vettoriale.
Potenti tecniche molecolari, come ad esempio il sequenziamento di nuova generazione, ora esistono per identificare le comunità microbiche e possono essere impiegati per caratterizzare vettoriale microbiomi sotto diverse condizioni ambientali o sperimentale. Prima dell’avvento di questi approcci di sequenziamento ad alte prestazioni, l’identificazione di microbi invocata principalmente la microscopia e la cultura. Mentre la microscopia è una tecnica rapida e facile, i metodi morfologici per l’identificazione di microbi sono inerentemente soggettivo e grossolana e limitato dalla bassa sensibilità e rilevamento di10. Metodi basati sulla cultura sono ampiamente utilizzati per identificazione microbica e possono essere utilizzati per determinare la suscettibilità dei microbi al farmaco trattamenti11. Tuttavia, questo metodo soffre anche di bassa sensibilità, come è stato stimato che meno del 2% dei microbi ambientali possono essere coltivato in un laboratorio impostazione12. Approcci di macchiatura istologici sono stati impiegati anche per rilevare e localizzare i microbi specifici all’interno di vettori, attivare indagini di varie distribuzioni di taxa all’interno il segno di spunta e studiare ipotesi circa le interazioni microbiche. Tuttavia, previa conoscenza dell’identità microbica è necessaria per la selezione le macchie appropriate, rendendo questo approccio inadatte per l’identificazione e caratterizzazione microbica. Inoltre, macchiatura istologica è un processo laborioso ad alta intensità di tempo e non si adatta bene per campioni di grandi dimensioni. Approcci molecolari tradizionali quali Sanger sequenziamento similmente sono limitati nella loro sensibilità e l’individuazione delle diverse comunità microbiche.
Sequenziamento di nuova generazione consente la rapida identificazione di microbi da un gran numero di campioni. La presenza di geni marcatori standard e consente maggiori database di riferimento enhanced risoluzione tassonomica, spesso a livello di genere o specie. Piccola unità secondaria ribosomal RNA sono frequentemente usati per raggiungere questo obiettivo, con 16S rRNA è il più comune a causa della presenza delle regioni conservate e variabile all’interno del gene, che permette la creazione di primers universali con ampliconi univoco per ogni batterico specie13,14. Questo rapporto dettaglia una procedura per l’identificazione dei taxa nel microbioma tick tramite sequenziamento del 16S rRNA generazione. In particolare, questo protocollo sottolinea i passaggi coinvolti nella preparazione dei campioni per il sequenziamento. Più generalizzata, dettagli sul sequenziamento e bioinformatica passaggi sono forniti, così come ci sono una varietà di piattaforme di sequenziamento e analisi programmi attualmente disponibili, ciascuno con ampia documentazione esistente. La fattibilità complessiva di questo approccio di sequenziamento di nuova generazione è dimostrata applicandolo ad un’indagine dell’Assemblea della comunità microbica all’interno di un vettore di malattia chiave.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prossima generazione sequenziamento del 16S rRNA è diventato un approccio standard per identificazione microbica e attivato lo studio di come vettore microbiomi influenzano la trasmissione dell’agente patogeno. Il protocollo descritto qui dettagli l’uso di questo metodo per indagare l’Assemblea della comunità microbica in I. pacificus, una specie vettore per la malattia di Lyme; Tuttavia, può essere applicato facilmente per studiare altre specie del battito o specie artropodi vettori.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation concede a A.S. (DEB n. 1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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