Здесь мы представляем протокол генетически изменить основной или расширенный человека природные (NK) киллеры с помощью Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Используя этот протокол, мы создали NK клеток человека недостаточно для превращения рецепторов фактора роста – b 2 (TGFBR2) и phosphoribosyltransferase гипоксантина 1 (HPRT1).
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии ускоряется генома техники во многих типов клеток, но до настоящего времени доставки генов и стабильной гена модификации были сложным в первичной НК-клеток. К примеру трансген доставки с помощью лентивирусные или ретровирусной трансдукции привели к ограниченной доходности генетически НК-клеток за счет существенной связанные процедуры NK клеток апоптоз. Здесь мы описываем ДНК, свободной метод для изменения генома человека основной и расширенный НК-клеток с использованием Cas9 рибонуклеопротеида комплексов (Cas9/RNPs). Этот метод позволил эффективно нокаут TGFBR2 и HPRT1 генов в клетки. RT-PCR данные показали значительное снижение уровня выражения гена, и цитотоксичность пробирного представитель ячейки продукта предложил, что RNP-Изменение NK клеток стали менее чувствительными к TGFβ. Генетически модифицированные клетки может быть расширение пост электропорация путем стимуляции с облученного mbIL21-выражая клетки фидера.
Иммунотерапия рака была выдвинута в последние годы. Генетически модифицированные химерных антигена рецепторов (автомобиль) Т-клетки являются отличным примером инженерии иммунных клеток, успешно развернуты в Рак иммунотерапия. Эти клетки были недавно одобрен FDA для лечения против CD19 + B клеток злокачественных опухолей, но успех пока ограничивается заболеваний, принимая несколько ориентации антигены и ориентации такого ограниченного антигенной репертуаров склонны к неспособности иммунных побег. Кроме того автомобиль Т-клетки были сосредоточены на использование аутологических клеток T из-за риска – трансплантат против – хост заболеваний, вызванных аллогенных клеток T. В противоположность этому НК-клетки способны убить цели опухолевого антигена независимым образом и не вызывают GvHD, что делает их хорошим кандидатом для рака иммунотерапия6,,78,9.
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технология была использована недавно в инженерных иммунных клеток, но генетически перепрограммирования НК-клеток с плазмид всегда была сложной. Это объясняется трудностями в доставке трансген зависимым образом ДНК как лентивирусные и антиретровирусным трансдукции, вызывая значительные связанные процедуры NK клеток апоптоз и ограниченное производство генетически NK клеток4 , 9.
Многие врожденные иммунные клетки Экспресс высокий уровень рецепторов для патоген связанные молекулярные модели, такие как ретиноевой кислоты inducible gene я (RIG-я), которые позволяют повышение признания иностранных ДНК. Подавление этих путей позволило более высокую эффективность трансдукции в НК-клеток при использовании методов на основе ДНК генетической модификации10.
Здесь мы описываем метод для использования свободных ДНК генома редактирования основного и расширенного NK клеток человека используя Cas9 рибонуклеопротеида комплексы (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs состоит из трех компонентов, рекомбинантные Cas9 белка complexed с синтетическими сингл руководство РНК состоит из complexed crRNA и tracerRNA. Эти Cas9/RNPs способны раскалывание genomic цели с более высокой эффективностью по сравнению с иностранными ДНК зависимая подходов благодаря их доставки как функциональных комплексов. Кроме того быстрое оформление Cas9/RNPs от клеток может уменьшить пробить эффекты, такие как индукции апоптоза. Таким образом они могут использоваться для создания плей аутов, или стук ins для гомологичная рекомбинация6,7в сочетании с ДНК. Мы показали, что электропорации Cas9/RNPs-это простой и довольно эффективный метод, который преодолевает предыдущие ограничения генетической модификации в НК-клеток.
TGFβ является основных иммуносупрессивные цитокинов, который ингибирует активацию и функции НК-клеток. Было высказано предположение о том, что ориентация на тропе TGFβ может увеличить функции иммунных клеток. Мы целевой регион кодирования TGBR2 ectodomain, который связывает TGFβ11. Представитель результаты показывают значительное снижение уровня экспрессии мРНК этого гена и далее демонстрировать, что изменение НК-клетки становятся устойчивыми к TGFβ. Кроме того измененные клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал, поскольку они способны быть расширенной пост электропорация облученного фидер клеток. Таким образом, следующий метод является перспективным подходом к генетически манипулировать НК-клеток для любого дальнейшего клинического или исследовательских целях.
ДНК зависимая модификация НК-клеток сложной4,9. Мы, таким образом, внедрили непосредственно комплекс синтетически преформированных рибонуклеопротеида (RNPs) и Cas9 белка как очищенный протеин в основной и расширенный NK клеток8. Этот метод позвол?…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем Брайан Tullius за его любезное помощь в редактировании рукопись.
RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
TGFβ | Biolegend | 580706 | |
Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |