Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.
Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus ideal bir viral vektör kullanarak bakteriyel yapay kromozomu (kuş hastalıkları, kuş gribi (AI), Newcastle hastalığı (ND) ve enfeksiyon bursal hastalıkları (IBD) gibi bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için olduğunu BAC) mutagenesis veya geleneksel rekombinasyon yöntemleri. Kümelenmiş düzenli olarak palindromik yineler (CRISPR) interspaced / Cas9 sistemi başarıyla kullanılan birçok ayarlarında gen düzenleme için birkaç büyük DNA virüs genleri manipülasyon dahil olmak üzere. Rekombinant galiba yüksek değerli hedef oluşturmak için hızlı ve verimli CRISPR/Cas9-aracılı genom düzenleme boru hattı geliştirdik. Bu yöntem potansiyel kullanımı en üst düzeye çıkarmak için burada IBDV VP2 protein ifade rekombinant galiba yüksek değerli hedef oluşturma yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi mevcut. VP2 ifade kaset eklenir galiba yüksek değerli hedef genom üzerinden bir NHEJ (nonhomologous son-katılma) içine-bağımlı onarım yolu. Yeşil floresans protein (GFP) ifade kaseti ilk kolay görüntüleme için INSERT bağlı olduğu ve daha sonra üzerinden Cre-LoxP sistemi kaldırıldı. Bu yaklaşım diğer viral antijenler galiba yüksek değerli hedef genom rekombinant aşı hızla gelişmesi için içine tanıtmak için etkili bir yol sunar.
Marek’ın hastalığı (MD) tavuk Alphaherpesvirinaealt cins Mardivirus serotip 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) tarafından indüklenen lenfoproliferatif hastalıktır. Mardivirus de iki nonpathogenic serotipleri içerir: 2 (GaHV-3) serotip ve 3 (MeHV-1, tarihsel olarak galiba yüksek değerli hedef bilinen) serotip MD. karşı aşı olarak kullanılır Canlı galiba yüksek değerli hedef aşı (FC-126 zorlanma) 1970’lerde kullanılan MD aşı ilk nesil ve hala yaygın olarak bivalent ve polivalan aşı formülasyonları MD. karşı gelişmiş bir koruma sağlamak üzere kullanılmaktadır Galiba yüksek değerli hedef, çok yönlülük ve güvenliği için ovo içinde ve subkutan kuluçkahane yönetimi ve yaşam boyu bağışıklık sağlamak için yeteneği nedeniyle kuş hastalıkların bir dizi karşı koruma ikna etmek için aşı vektör olarak da yaygın olarak kullanılır. Rekombinant galiba yüksek değerli hedef aşı üretmek için strateji ya geleneksel Homolog rekombinasyon virüs bulaşan hücreleri, üst üste gelen cosmid DNA’lar veya BAC mutagenesis2temel alır. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman alıcı ve emek yoğun, gerektiren transfer vektörel çizimler inşaat, Escherichia coli, plak purifications viral genom bakım ve BAC sıra ve seçimi kaldırma Marker düzenlenen virüs3,4.
CRISPR / (Cas9) ilişkili düzenleme aracı çok yönlülük ve özgüllüğü nedeniyle son yıllarda en popüler gen olduğunu. CRISPR/Cas9 sistemi başarılı bir şekilde verimli üretimi hayvan modelleri5,6,7,8,9,10, ve genetiği değiştirilmiş hücreler olarak kullanılmıştır birkaç büyük DNA virüs genleri11,12,13,14,15,16,17manipülasyon de olduğu gibi 18,19,20. Galiba yüksek değerli hedef genom21düzenlemek için CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak basit ve etkili bir yöntem raporlama sonrasında, biz bir boru hattı rekombinant galiba yüksek değerli hedef22hızlı ve verimli oluşturmak için geliştirilmiştir.
Bu yöntemin olası uygulama genişletmek için biz ayrıntılı metodoloji rekombinant IBDV UL45/46 odağı bu raporda, VP2 gen ifade galiba yüksek değerli hedef aşı üretimi için açıklar. Yaklaşım GFP muhabir gen ve GFP ifade kaset daha sonra kaldırmak için bir Cre-LoxP sistemi etiketli VP2 gen eklemek için NHEJ-CRISPR/Cas9 birleştirir. Geleneksel rekombinasyon ve BAC recombineering teknikleri ile karşılaştırıldığında, NHEJ-CRISPR/Cas9 Cre-Lox sistemi ile birlikte rekombinant galiba yüksek değerli hedef aşı üretmek için hızlı ve verimli bir yaklaşım olduğunu ispat.
CRISPR/Cas9 sistem gen düzenleme değerli bir araç haline gelmiştir. Geleneksel teknolojiler rekombinant Homolog rekombinasyon13 ve BAC mutagenesis teknoloji25, gibi galiba yüksek değerli hedef vektör geliştirme için genellikle birkaç tur vektör klonlama ve seçimi, aynı zamanda büyük ölçekli tarama dahil, Hangi birkaç ay sürebilir. Burada Cre-Lox sistemi ve tek hücreli sıralama ile birlikte bir NHEJ CRISPR/Cas9-tabanlı strateji kullanarak açıklanan daha uygun, verimli ve daha hızlı bir yaklaşım rekombinant aşı üretimi iletişim kuralıdır. Bu boru hattı kullanarak, rekombinant virüs sadece 1-2 hafta24saat içinde elde edilebilir ve plak arıtma adımları da floresan aktif hücre17sıralama kullanarak bir tek yönlü ayrılık azaltılabilir. GRNA tasarım ve donör inşaat saflaştırılmış rekombinant galiba yüksek değerli hedef virüs elde etmek için tüm süreç 1 ay içinde elde edilebilir. Başarılı rekombinant galiba yüksek değerli hedef üretimi için kritik adımlar yabancı gen ekleme, yüksek transfection verimliliği için Cas9 olasılığını en üst düzeye çıkarmak için verimli bölünme sağlamak için viral genom hedefleme için yüksek verimli gRNA seçim içerir / gRNAs ve düzenleme için aynı hücreye ve donör ve gRNA plazmidleri transfection ve Cas9 ve gRNA virüs hücrelere ulaşmadan önce makul bir düzeyde ifade edilecek izin vermek için viral enfeksiyon 12 saat aralığını karşılamak için virüs.
Galiba yüksek değerli hedef rekombinant üretimi için GFP pozitif tanımlaması karmaşıklığı tarafından Kavşağı PCR klonlar kısıtlamadır. GFP-VP2 kaset her iki yönde tarafına eklenemedi. PCR burada açıklanan kavşak anlamda yönlendirme INSERT tanımlaması sadece içindir. INSERT antianlamlı yönde durumunda açıklanan astar çiftleri kullanılarak PCR işe yaramaz ve iç astar bu amaç için takas. Başka bir potansiyel donör yapı yalnızca kalan LoxP sırası bir gen ekleme GFP çıkarıldıktan sonra-aynı virüs varlığı nedeniyle Cre tedavi tarafından kullanılabileceğini sorundur. Bir değişken LoxP sırası ile yeni bir donör yapı yerine birden çok ekleme amaç için kullanılabilir.
NHEJ ve HDR (Homoloji yönetmen onarım) Cas926,27tarafından oluşturulan çift iplikçikli sonları (DSBs) onarmak için iki yolları vardır. NHEJ ise HDR daha az verimlidir ve sadece S ve G2 aşama6,29,30sırasında oluşur hücre döngüsü28, gerçekleştiği sırada daha verimli olur. Hedeflenen konumlara yabancı genlerinin tanıtmak için daha verimli NHEJ onarım yolu burada istismar. Her ne kadar NHEJ tamir indels noncompatible veya zarar görmüş DNA uçları ile i ciddi donör sırası ve genomik DNA, indels arasında bir Homoloji bağımsız mechanistically esnek işlem31,32 katılarak tanıştırabilir miyim Sadece sgA bölünme sitelerinde ortaya çıkabilir ve yabancı gen ekspresyonu kaset etkilenmez. Bu yaklaşımın başka bir avantajı NHEJ çok basit adım klonlama yapma Homoloji kol inşaat, kısıtlama ücretsiz olmasıdır. Bu NHEJ uygulaması yabancı gen ekleme için büyük bir potansiyele ister. Her ikisi de bir evrensel gRNA hedef sitesinin giriş yabancı gen kaset yapar donör şablonu hemen gerek belirli gRNA seçim için ile inşa edilebilir daha hızlı işlemi sonlandırır. SgA hedef siteleri, LoxP siteleri ve PacI ve SFII siteleri içeren donör plazmid omurgası da yaygın olarak farklı reporter genler, yabancı gen ekspresyonu kaset ve farklı virüs vektörler, bu yeni yaklaşımın avantajı veren arasında paylaşılabilir özelleştirme.
Galiba yüksek değerli hedef yataklık VP2 Ekle bu el yazması protokolünde tanımlamak için kullanılan; Ancak, aynı yaklaşımı farklı genomik yerlerde istediğiniz karşılık gelen sıra multivalent rekombinant yönlendirdik galiba yüksek değerli hedef aşıların geliştirilmesi için hedefleme gRNA kullanarak galiba yüksek değerli hedef genomunun daha viral genler eklemek için kullanılabilir. SB-1 ve CVI988, bulaşıcı laryngotracheitis virüs ve ördek enterit virüs ve ayrıca diğer kuş DNA gibi virüsler çiçeği virüs ve adenovirüse bakın, dahil olmak üzere diğer kuş herpesviruses gibi diğer MDV aşı suşları da kullanarak tasarlanmış yaklaşım multivalent rekombinant aşı geliştirme için. Burada açıklanan CRISPR/Cas9 sistemi platformu kullanarak yeni multivalent Vektörlü aşıların geliştirilmesi birden fazla kümes hayvanları hastalıklara karşı korumak kümes hayvanları endüstrisi için son derece yararlı olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Pippa Hawes confocal görüntüleme ile yardım ettiğin için teşekkür ederim. Bu proje biyoteknoloji tarafından desteklenen ve BBS/E/ı/00007034 ve 1/L014262/BB Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) verir.
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |