Le principal objectif du présent protocole est d’isoler efficacement les cultures viables glomérules primaire avec des contaminants minimales pour une utilisation dans un large éventail d’applications en aval. Les glomérules isolés conservent des relations structurelles entre les types de cellules composant et peuvent être cultivées ex vivo pendant une courte période.
Préservation de la structure glomérulaire et la fonction est essentielle dans la prévention de glomérulonéphrite, une catégorie de maladie rénale caractérisée par une protéinurie qui peut éventuellement conduire à la chronique et l’insuffisance rénale terminale. Le glomérule est un appareil complexe responsable de la filtration du plasma du corps. Dans la maladie, l’intégrité structurale est perdue et permet la fuite anormale des matières de plasma dans l’urine. Une méthode pour isoler et étudier les glomérules dans la culture est essentielle pour l’étude de ces maladies. Dans le présent protocole, on décrit une méthode efficace de récupérer intacts glomérules des reins de rat adulte tout en conservant les caractéristiques structurales et morphologiques. Ce processus est capable de générer des rendements élevés des glomérules par rein avec une contamination minimale d’autres segments du néphron. Avec ces glomérules, conditions de blessure peuvent être imitées en incubant eux avec une variété de toxines chimiques, y compris du sulfate de protamine, qui provoque le pied effacement de processus et de la protéinurie chez les modèles animaux. Degré de préjudice peut être évaluée à l’aide de la microscopie électronique à transmission, immunofluorescence souillant et éponger occidental. Néphrine et taux 1 de tumeur de Wilms (WT1) peuvent également être évaluées de ces cultures. En raison de la facilité et la flexibilité du présent protocole, les glomérules isolés peuvent être utilisés tel que décrit, ou d’une manière qui répond le mieux aux besoins du chercheur pour aider la meilleure étude santé glomérulaire et la structure dans les Etats malades.
Le glomérule est une touffe hautement spécialisée des capillaires responsables de la filtration du plasma en circulation. Elle forme le début du néphron, qui est l’unité fonctionnelle de base du rein. Fonction glomérulaire est définie par un endothélium capillaire unique fenêtré, la membrane de la fente des podocytes et une membrane basale intermédiaire. Ces couches forment une barrière semi-perméable permettant l’excrétion sélective des substances dans le filtrat. L’eau, d’ions et autres petites molécules passent généralement par, tandis que les plus grosses molécules sont conservés dans le plasma. Podocytes sont des cellules épithéliales spécialisées qui se répandent sur la membrane basale, qui entourent les capillaires avec des projections cytoplasmiques appelées processus de pied. Le pied traite des podocytes adjacentes pavimenteuses et est traversé par des diaphragmes de fente composés de protéines telles que néphrine, podocin, P-cadhérine et ZO-11. En coupe transversale, ces pieds processus sont uniformément disposées sur la membrane basale. Dans les glomérules malades, le processus de pied devient grossièrement anormale ou « effacés », menant à une fuite anormale des matières de plasma dans le filtrat. Ainsi, les lésions glomérulaires sont caractérisées par la présence de quantités anormalement élevées de protéines (p. ex., protéinurie) et/ou de globules rouges (p. ex., hématurie) dans l’urine. En outre, les podocytes blessés perdre expression de néphrine ainsi que son régulateur 1 tumeur de Wilms (WT1), une protéine clé responsable de la maintenance de différenciation2,3. Les glomérules sont une cible principale des dommages dans la néphropathie diabétique et autres glomerulonephritides comme la maladie minimale de changement, néphropathie membraneuse et glomérulosclérose segmentaire. Ces maladies sont des causes majeures de l’insuffisance rénale progressive et le développement de l’insuffisance rénale terminale, une condition dans laquelle la survie repose sur la dialyse ou transplantation rénale. Par conséquent, il est important d’étudier les glomérules pour comprendre la pathologie des maladies rénales chroniques.
Un système de culture cellulaire est essentiels à l’étude de la biologie glomérulaire. En raison de son rôle central dans la génération de la membrane de la fente, ainsi que l’existence de certaines maladies protéinuries due à des mutations de protéine de membrane fente, beaucoup de recherches a tout naturellement utilisé le podocyte isolément. Cela a conduit à la génération de lignées cellulaires primaires podocyte d’utiliser in vitro. Ces cellules peuvent être cultivées dans une variété de conditions et peuvent même être cultivés sur des supports perméables pour évaluer la perméabilité4. Toutefois, l’isolement des cellules en prolifération souvent sélectionne les cellules dédifférenciées qui ont perdu certains de leurs marqueurs podocyte. Cela a conduit à la génération des podocytes conditionnellement immortalisées dérivé d’une souche de souris transgéniques portant un mutant thermosensibles SV40 grand T du gène de la (par exemple immortomouse), qui pourrait être cultivé en culture, mais aussi être différenciés pour exprimer toute une gamme de marqueurs de podocyte5. Ces méthodes de culture primaire ont été déterminant dans la compréhension podocyte biologie4,6,7.
Néanmoins, cultures contenant des types de cellule unique n’ont pas les relations intercellulaires qui se produisent in vivo ainsi que la structure de soutènement et matrices et monocouches de ces cellules ne pas nécessairement récapituler tridimensionnelles architecture des glomérules. Les podocytes immortalisées peut également être lourd et difficile à la culture de8et exigent la possession de l’autre immortomouse ou une portion de départ de cellules d’établi enquêteurs pour commencer. En outre, le glomérule regroupe non seulement podocytes, mais aussi les cellules endothéliales des capillaires et la membrane basale, ainsi que les cellules mésangiales qui assurent un soutien pour la structure. Il est donc utile de développer une ex vivo approche disponible à tous les chercheurs pour l’étude des glomérules intacts qui conservent leur architecture native ainsi que toutes les cellules constituant le glomérule normal.
En 1958, Cook et Pickering a décrit le premier isolement des glomérules du rein de lapin. Après les observations que l’embolie est devenu déposée dans les glomérules, ils ont postulé que les particules de taille identique pourraient servir à isoler spécifiquement ces structures. En effet, l’injection de particules d’oxyde de fer dans le rein a conduit à la capture de ces particules dans les glomérules. Après dissociation mécanique et tamisage du rein, les glomérules pourraient être isolés intact et avec pureté grâce à l’utilisation de la séparation magnétique,9. En 1971, Misra a montré que l’oxyde de fer perfusions pouvaient être supprimées et l’isolement glomérulaire réalisé avec tamisage d’homme hachée, chien, lapin ou rat rein tissu10. Cette technique a été modifiée depuis puis selon l’objectif des enquêteurs mais a essentiellement entraîné des préparations purifiées qui pourrait être approfondie ou dont les cultures de cellules primaires pourraient être établi11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement d’intacts viables glomérules du rein de rat. L’ensemble du protocole prend seulement quelques heures. Bien qu’ils ne prolifèrent pas, les plans expérimentaux de toute taille peuvent être soutenus en augmentant tout simplement le nombre de reins comme matériau de départ. Bien qu’il existe des protocoles publiés pour la séparation de billes magnétiques des glomérules, ils nécessitent une injection intraveineuse de perles, sont plus chers et peuvent altérer la biologie puisque les perles sont soit conservés par les glomérules en culture ou exigent glomérulaires » lyse » et extraction par centrifugation,19. Par rapport aux glomérules de souris, la grande taille de glomérules de rat (près de 100 µm en deux mois vieux rats18) rend beaucoup plus facile de les séparer des autres structures du rein à l’aide d’une technique simple de tamisage.
Comme preuve de leur utilité, nous avons caractérisé les glomérules pour illustrer les différents types de cellules. Elles peuvent être exposées à des agents connus pour blesser les glomérules in vivo, et on démontre les effets néfastes du sulfate de protamine (PS) sur ces cultures. PS est une polycation qui neutralise les sites anioniques le long de la paroi capillaire glomérulaire20. Cette neutralisation a un effet dramatique sur la barrière de filtration glomérulaire et donc augmente la protéinurie et pied effacement de processus. Ces glomérules pouvant être évaluées par immuno-Blot pour les protéines clés tels que néphrine et WT1 afin d’évaluer l’état de santé général. En outre, leur structure peut être évaluée avec, immunofluorescence, microscopie photonique et électronique.
Dans l’ensemble, ce protocole est accessible à la plupart des enquêteurs (il suffit d’un accès pour les animaux et du matériel simple). Avec des caractéristiques morphologiques, laissés intacts, le chercheur est en mesure d’analyser les glomérules et voir comment les autres types de cellules importantes et préservation de matrice dans les glomérules affectent la fonction et maladie la progression, une lacune des cultures podocyte.
Il s’agit d’une méthode efficace pour la récupération des glomérules du rein de rat à l’aide de matériel peu coûteux et réutilisable avec un protocole simple. Comme pour toutes les procédures, il y a des limites à son utilité. Tout d’abord, même si nous obtenons une pureté > 95 %, en raison de la nature par tamisage du protocole et de la matière, qu’il est impossible d’exclure tous les contaminants et quelques globules rouges et le segment tubulaire occasionnel seront présents dans la culture. Nous ne prévoyons pas de ces petits contaminants pour être un problème pour la grande majorité des applications. En second lieu, le protocole de tamisage repose sur l’utilisation de reins de rats, dans lequel les glomérules sont beaucoup plus grandes que chez les souris. Si les glomérules de souris sont nécessaires, une technique qui utilise des billes magnétiques commerciales (p. ex., billes) a été publié22. En troisième lieu, il a été démontré qu’ARNm spécifiques (PAI-1 et le collagène I) en glomérules isolés proviennent presque entièrement de la capsule de Bowman plutôt que des cellules d’intraglomerular23. Cela pourrait conduire à des conclusions inappropriées si l’isolement de l’ARNm est tentée de ces glomérules. Il est à noter que, dans nos mains, la majorité des glomérules est décapsulés et il manque donc des contributions importantes à partir de capsules de Bowman. Quatrièmement, la mort cellulaire commence à se produire relativement rapidement dans des conditions de culture.
Nous avons constaté que le programme apoptotique, comme en témoignent les aspect clivé caspase-3, a été activé à partir de 2 h de culture. Il s’agit en général d’accord avec les rapports précédents montrant que l’apoptosis, tel qu’évalué par fragmentation ADN, TUNEL et l’analyse histologique, commence à se produire dans les 1-2 h après isolement24. Toutefois, il convient également de noter que premières observations ont montré que l’activité métabolique pu détecter de glomérules isolés de tamisé lorsque cultivées pendant au moins 3 h, suggérant la viabilité cellulaire considérable à ce validant16. Néanmoins, selon les résultats, nous pensons qu’il serait prudent d’utiliser des glomérules isolés immédiatement dans les expériences prévues pour de meilleurs résultats. Nous recommandons que toutes les expériences être exécutés avant 72 h que nous avons observé que l’ensemble de la structure glomérulaire commence à se détériorer au-delà que validant.
Il est plus facile d’obtenir des rendements plus élevés lors du démarrage avec 4-8 reins plutôt que de seulement 2 parce qu’un certain nombre de glomérules est perdu en raison de l’adhésion pour les tamis différents, mais une fois que les tamis sont enduits au maximum il n’y a aucune perte supplémentaire. Pour la même raison, il est important de laisser tremper les tamis dans le BSA/PBS tampon à avant utilisation que les glomérules sont plus susceptibles d’adhérer à un tamis de sec et de limiter l’exposition des tissus sur un bord de la passoire. Nous vous suggérons de commencer par pas moins de 6 reins (3 rats) afin d’obtenir un rendement raisonnable.
Certains chercheurs ont isolé des cultures primaires podocyte de glomérules isolés qui ont tendance à se développer hors les glomérules au cours de la culture,17. Nous avons noté que certains glomérules isolés respectera le plastique de plat de la culture et que les cellules vont commencer à migrer hors de la structure glomérulaire à fin h (72 h après l’isolement). L’étude de ces cellules déborde le cadre de ce protocole d’isolement, et il y a une certaine controverse quant à savoir si ces cellules sont les podocytes, cellules épithéliales pariétales ou15,25. Notamment, algerienne et coll., ont rapporté que cellules pavées récoltées dans les glomérules tamisées être incitées à se différencier en podocytes mature sous particulier cultivant des conditions26. La confusion au sujet de l’identité de la cellule peut dépendre de savoir si les glomérules isolés sont encapsulés (y compris la capsule de Bowman, qui est peuplée par les cellules épithéliales pariétales) ou décapsulés dans la procédure par tamisage. Dans nos mains, à l’aide de tamis séquentielle de 180, 90 et 75 µm a conduit à la majorité des glomérules étant décapsulés.
La plupart des formes de la maladie rénale chronique albuminuriques sont dû à une augmentation de la perméabilité glomérulaire. Plusieurs auteurs ont utilisé des glomérules isolés dans les expériences de perméabilité ex vivo . Dans une méthode, le changement de volume glomérulaire après avoir modifié la teneur osmotique des médias environnants a été utilisé pour estimer la perméabilité27. Récemment, il a été établi que la fuite d’une sonde fluorescente de glomérules isolés ont pu être quantifié pour mesurer la perméabilité et pourrait être réalisée chez les rongeurs exposés à la maladie glomérulaire des modèles expérimentaux28.
Nous avons noté que dans le processus de préparation de TEM, nous voyons parfois le podocyte processus soulever la membrane basale des pieds. Nous ne croyons pas ce qui se passe dans la culture et est plus probablement un artefact au cours de la préparation d’échantillons TEM. En particulier, même lorsque dans ce cas, il est clair que les processus de pied apparence « normales » ou sont effacés.
Dans l’ensemble, ce protocole fournit une méthode par laquelle on peut évaluer les changements morphologiques et cellulaires en réponse à une lésion. Nous prévoyons qu’il peut être utilisé comme une technique complémentaire aux cultures podocyte isolé, surtout quand les interactions avec la matrice extracellulaire ou autres types de cellules natives sont envisagées. C’est prometteur pour accroître la compréhension des albuminuriques CKD, qui permettrait d’améliorer la capacité de développer de futurs traitements pour cette maladie débilitante.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les American Heart Association grant 16990086 FTF, NIH P30 DK079307, American Society of néphrologie Gottschalk Award, un University of Pittsburgh Medical Center concurrentiel Medical Research Fund Award et une Université de Pittsburgh Prix de la fondation universitaire de médecins. Nous remercions Gérard Apodaca pour ses suggestions techniques pour préservation glomérulaire pour analyse histologique, Mara Sullivan et Ming Sun pour l’assistance au microscope électronique et Yingjian Li et Youhua Liu pour leur apport technique dans le présent protocole. Nous remercions également les anticorps CD31 Cynthia St. Hilaire.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |