Summary

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Published: August 18, 2018
doi:

Summary

Efferocytosis, фагоцитарной удаление apoptotic клеток, необходимых для поддержания гомеостаза и облегчается рецепторов и сигнальных путей, которые позволяют для распознавания, поглощения и интернализация apoptotic клеток. Здесь мы представляем протокол микроскопии флуоресцирования для количественной оценки efferocytosis и активность efferocytic сигнальные пути.

Abstract

Изучение правил efferocytosis требует методы, которые способны точно подсчитать поглощение apoptotic клеток и датчик сигнализации и клеточных процессов, которые управляют efferocytosis. Эта количественная оценка может быть трудным для выполнения как apoptotic клетки часто efferocytosed по частям, таким образом создавая необходимость методы, которые можно точно описать между efferocytosed часть целевого объекта apoptotic против остаточного unengulfed сотовых фрагменты. Подход, изложенный в настоящем документе использует двойной маркировки подходы к точно количественно оценить динамику развития потенциала efferocytosis и efferocytic efferocytes, такие как макрофаги. Помечены цитозоль клетки apoptotic клетки отслеживания краситель, чтобы включить мониторинг всех apoptotic клеток, полученных материалов, в то время как поверхности biotinylation apoptotic клетки позволяет для дифференциации между внутренним и не учитываются apoptotic клеток дробей. Объем efferocytic efferocytes определяется принимая флуоресцентного изображения клеток живых или фиксированной и количественной количество связанного против внутренней цели, как дифференцированные по окрашиванию стрептавидина. Этот подход обеспечивает несколько преимуществ над методы, такие как проточной цитометрии, а именно точное разграничение не efferocytosed против efferocytosed apoptotic клеток фракций, возможность измерения динамики efferocytic, микроскопия живой клетки и способность выполнять исследования клеточной сигнализации в клетках, выражая дневно меченых трансгенов. Комбинированные, методы, изложенные в настоящем Протоколе служат основой для гибкого экспериментальный подход, который может использоваться для точного количественного определения efferocytic активности и допросить сотовой сигнальных путей, активные во время efferocytosis.

Introduction

Apoptosis или запрограммированная смерть клетки, является высоко регулируется физиологический процесс, который происходит в большинстве многоклеточных организмов и имеет решающее значение для их развития и гомеостаза1. Помимо участия в нормальной клетки оборота и эмбрионального развития, апоптоз позволяет ликвидации зараженных или поврежденных клеток тканей и может срабатывать в ответ на инфекции, воспаления, рак, а также медицинских вмешательств Например, лучевой терапии или стероидов1. Apoptotic клетки разоблачить «едят-me» сигналы на их поверхности клетки, которые признаны рецепторов на широкий спектр профессиональных и непрофессиональных фагоцитов, именуемые далее «efferocytes». Участие этих рецепторов вызывает поглощения и деградации apoptotic клетки, efferocyte через процесс, известный как efferocytosis2,3. Фосфатидилсерин лучше всего характеризуется едят-мне сигнал вождения efferocytosis. Обычно ограничивается внутренним листовка плазматической мембраны, с apoptosis, активация скрамблаза липидов, которая нарушает этой асимметрии мембраны, тем самым подвергая Фосфатидилсерин на поверхности клеток4. Фосфатидилсерин находится на поверхности внеклеточного-apoptotic клеток, таких как зрелые макрофаги и активации тромбоцитов. Однако эти клетки являются не efferocytosed из-за присутствия «не ешь меня» сигналов, таких как CD47, на их клеток поверхности5,6,7. Подвергаются Фосфатидилсерин признается массив efferocytic рецепторов, выраженную efferocytes. Связывание этих рецепторов к Фосфатидилсерин, либо непосредственно, либо через помощи опсонины, активирует сигнальных путей, способствующих сплошным apoptotic клеток в вакуоль мембраны прыгните называют efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome предохранители последовательно с endosomes и лизосомы, которые доставляют молекулярный механизм, необходимый для подкислять efferosome и ухудшить apoptotic клетки грузов13,14. После того, как деградация, apoptotic клеток производные материалы продаются в утилизации endosome — процесс, который ограничивает иммунных реакций к apoptotic клеток антигены, и которая может позволить для восстановления питательных веществ из клетки apoptotic13, 15. Неудача в efferocytosis результаты в нарушение Распродажа apoptotic клеток; в конечном итоге эти необезвреженные клетки претерпевают вторичные некрозы. Отмершие клетки релиз про воспалительных цитозольной содержимое, патогенов и autoantigens в внеклеточной окружение, таким образом, движущей широкий спектр инфекционный, воспалительных и аутоиммунных заболеваний16,17. Вместе, апоптоз и efferocytosis облегчить удаление мертвых и умирающих клеток и для поддержания гомеостаза ткани.

Изучение молекулярных механизмов лежащих в основе efferocytosis требует методы, которые обеспечивают четкую количественную оценку apoptotic клеток поглощения. Эта количественная оценка осложняется тем, что в отличие от других поглощения таких механизмов, как эндоцитоза и фагоцитоз18,19, efferocytosis не может привести к сплошным нетронутыми целевой ячейки, в результате частичного поглощения apoptotic клетки efferocyte20. Протокол, описываемые описывает в пробирке efferocytosis assay который обеспечивает точное разграничение интернализированных против-внутреннюю часть индивидуальных apoptotic клеток и могут быть объединены с целым рядом-клеток и микроскопия живой клетки подходы. Традиционные фагоцитоза анализов добавить антитела специфические фагоцитарной цели в конце эксперимента для того, чтобы называть не учитываются цели, где наш метод отличается маркировки apoptotic цель с ковалентно связан биотина21 , 22. в то время как apoptotic клеток специфические антитела могут использоваться в этом assay, biotinylation подход позволяет для любого целевого белка подшипник быть помечены и избегает потенциальных проблем с перекрестной реактивности вторичные антитела, если выполняется иммуноокрашивания . В частности мы наметим подготовки apoptotic клеток Jurkat, которые были двойной окрашенных клеток отслеживания красителя и биотин. Ячейка, отслеживания краситель позволяет для apoptotic клеток, полученных материалов быть считано во время efferocytosis, тогда как поверхности biotinylation позволяет для дискриминации внутреннюю от-внутреннюю часть efferocytosed apoptotic клеток. Мы также описывают культуру и подготовка J774.2 и THP-1 клеточных линий для использования в качестве мышиных и человеческого efferocytes, моноцитарных м2 макрофагов в качестве примера главной ячейки efferocytosis, и Jurkat клетки для использования как efferocytic целей. Эти методы легко может применяться для других клеточных линий или первичной клетки, клетки-мишени любой форме клеточной смерти (например апоптоза, некроз и necroptosis) и имитирует микронного размера, имитирующие apoptotic клетки через липидного покрытия или покрытие с лигандами, специфичные для efferocytic рецептор интерес.

Метод, изложенные в настоящем Протоколе имеет ряд преимуществ над методами цитометрии на основе потока, широко используется в области23,24. Непосредственно визуализации фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействия, в сочетании с четкой маркировки как общая и не учитываются apoptotic клеток материала, можно сделать количественные показатели efferocytosis. Кроме того использование рН нечувствительным флуорофоров ограничивает отягощающих факторов, таких, как подавление FITC и GFP флуоресценции в лизосомальных рН, который смешивает некоторые альтернативные методы25. И наконец, хотя не подробно, эти методы могут быть использованы с помощью efferocytes, выражая дневно меченых трансгенов, или с иммуноокрашивания после фиксации, для количественной оценки сигнальные молекулы деятельность и мониторинг клеточные процессы во время efferocytosis.

Protocol

Сбор крови от здоровых добровольцев был одобрен Советом здравоохранения этики научных исследований науки в университете Западного Онтарио. Венепункции была выполнена в соответствии с руководящими принципами изложения политики Tri-Совет по исследований человеческого. 1. …

Representative Results

Культура клеток Jurkat с 1 мкм staurosporine результаты в апоптоз в одночасье > 95% клеток, которые могут быть подтверждены с Annexin V окрашивание (рис. 1). Другие типы клеток может использоваться для этих экспериментов, хотя концентрация staurosporine и продолжительность ле?…

Discussion

Методы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют изображений и количественной оценки процесса динамического efferocytic, используя подходы в-клеток и клеток. Эти подходы предлагают несколько преимуществ над обычно занятых потока методы на основе цитометрии23,<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Канадским институтов медицинских исследований (КНИИЗ) действующих грантов СС-123419, естественных наук и инженерных исследований Совет из Канады обнаружения Грант 418194 и Онтарио Министерство исследований и инноваций ранних исследований премии для BH. DGW способствовали некоторые из изображений, представленных, оптимизации протоколов и написания манускрипта; Он финансировался насоса грунтование грант от Ливерпульского университета. CY финансируется Ванье Магистратура стипендии и КНИИЗ MD/PhD студенчества. Финансирующие учреждения имели никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Materials

RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. , 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -. Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Play Video

Cite This Article
Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

View Video