Summary

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

Published: July 30, 2018
doi:

Summary

プロトコルでは、平面脂質二重膜を用いたシナプス インターフェイスを形成する主なポリクローナル T 細胞の機能を研究する手法について説明します。主に由来するリンパ節、末梢血 T 細胞の差動シナプス形成機能を表示するのにこの方法を使用します。

Abstract

原動力の現在の理解と T 細胞シナプス インターフェイスの構造機能主平面膜のガラス サポートと体外を使用して決定されています-派生 T 細胞クローンまたはライン1,2 ,3,4。主なヒト T 細胞由来の血液やリンパにこれらの調査結果を適用方法組織知られていない、分析5セルの十分な数を得ることに重要な難しさもあって。ここで活性化し、接着分子を含む平面脂質二重膜を構築するマルチ チャンネル流れスライドを利用する技術の開発を通じてこのアドレスします。流れスライドの高さの低いシナプス界面形成のダイナミックや顆粒放出の速度論を研究する研究者、細胞: 二重添付ファイルを同期するために急速な細胞沈降を促進します。この 10 数としてシナプス インターフェイスを分析するアプローチを採用4 105一次凍結 T 細胞リンパ節 (LN) と末梢血 (PB) から分離されました。新規平面脂質二分子膜技術できる主な T 細胞由来の血液と健康と病気のコンテキストで組織の生物物理特性の研究結果が明らかに。

Introduction

T 細胞免疫シナプスおよび T 細胞の機能的活動へのリンクの構造機能の科学的知識は、細胞株の研究から主に生成されているし、PB 由来のクローンを作成します。得られる主な T 細胞に関連してこれらの結果どの程度人間のリンパ組織または血液不明のまま、リンパやその他の組織に存在する T 細胞のシナプスのインタ フェースはこれまで分析されていません。重要なは、新たなデータは住民組織とリンパ器官由来の T 細胞表現型、PB6,7で機能活性に有意差があることをお勧めします。これはさらに主な人間の T 細胞の T 細胞のシナプス インターフェイスの機能を理解する必要性を凝固しました。

このため、私たち人間の PB および LN から分離された未満 105主な T 細胞の T 細胞/二分子膜のイメージングを実行するを有効にするマルチ チャンネル流れスライドに組み込まれた脂質二重膜を利用した新規ミニスケール アプローチを開発しました。この手法より良いモデルし、生体内で細胞間の相互作用を理解するために主な人間の T 細胞シナプスのインターフェイスの生物物理学的特性の研究をことができます。

Protocol

本研究はヘルシンキ宣言に基づき行った。すべての参加者から書面によるインフォームド コンセントを得たし、血とリンパ節のサンプルは、ペンシルベニア州立大学 (IRB #809316、IRB # 815056) 制度検討委員会の承認を得て買収されました。すべての被験者は、大人でした。臍帯血サンプルは、トーマス ・ ジェファーソン大学産科婦人科分娩によって提供された親切。すべてのサンプルはデ識別?…

Representative Results

まず、臍帯血由来の活性化 CD8 によって形成されるシナプスのインターフェイスの構造を比較した+ T 脂質二重膜の細胞構築いずれかの伝統的な大規模なフロー電池システム (詳細については材料の表を参照してください)1 ,2,3,4またはマルチ チャンネル…

Discussion

ここで説明する手法コンベンショナル フロー セル5平面膜の構築に必要な同じような試薬を利用し、人間の T 細胞-二層のプライマリ インターフェイス3,4 のイメージングを実行する正常に適用することができます。 ,15。技術蛍光分子使用量の大幅な削減を提供しています 10-20 x フロー電池システム<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品が支持されたマイケル r. ベッツに R01AI118694 NIH グラント、サブ賞 566950 百合 Sykulev に含まれています。我々 は、シドニー ・ キンメルがんセンター バイオ イメージング共有リソースに優れたサポートをありがちましょう。

Materials

CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

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Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

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