Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme
Summary
Bu iletişim kuralı oküler yüzey için bir aşınma fare indirebilmek için ve yara iyileşme süreci bundan sonra izlenecek yöntemi açıklanır. Protokol kısmen göz yüzey epitel anaesthetized farelerde kaldırmak için oküler bir burr yararlanır.
Abstract
Fare kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sağlar. Kornea gözün en dış tabakası ve böylece ilk savunma sakatlığı. Aslında, klinikte buldum göz yaralanma en yaygın türü bir kornea aşınma var. Burada, biz bir oküler burr imzalat fareler üzerinde kornea epitel vivo kaldırılması sonuçlanan bir aşınma ikna etmek için kullanmaktadır. Bu yöntem diğer alanlarda dokunmadan hedeflenen ve tekrarlanabilir epitel bozulma için izin verir. Buna ek olarak, floresein boyama ile aşınır epitel görselleştirme açıklar ve nasıl aşınır kornea görselleştirmek için somut tavsiyeler sağlar. Sonra yara yara yeniden epithelialized kadar aşınma sonra 0, 18 ve 72 h şifa kronolojisi izleyin. Kornea yaralanma epitel aşınma modeli epitel hücre çoğalması, geçiş ve kornea katmanların yeniden epithelialization çalışmalar için idealdir. Oküler burr stromal hücre katmanlarına nüfuz etmez çünkü ancak, bu yöntem stromal etkinleştirme sırasında yara iyileşmesi, eğitim için en uygun değildir. Bu yöntem ayrıca örneğin, önceden klinik test ilaç etkinliğinin klinik uygulamalar için uygundur.
Introduction
Çok sayıda organları epitel tabakalarının yaralanmalara maruz kalır. Ancak, onlar da yara iyileşmesi ile doku kaybı telafi etmek için yeteneğini içerir. Kornea yara iyileşmesi eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Gözün dış yüzey oluşturur ve hassas oküler makine için bir koruyucu tabaka sağlar. Böylece, kornea patojenler ve su kaybı için fiziksel bir bariyer görevi görür. Üç katmandan oluşur; epitel, stroma ve endotel. Kornea epitel kornea dıştaki katman yapar. Epitel hücreleri kesinlikle birbirine sıkı kavşak1,2,3ile bağlı kalarak tarafından kornea bariyer fonksiyonunu korumak. Bir acellular kornea membran, Bowman’ın membran, ateşe dayanıklı keratocytes içeren kapsamlı stroma epitel ayırır. Stroma altında besin, su ve oksijen üst katmana endotel hücreleri kanal.
Kornea aşınmalar klinik4‘ te çok yaygındır. Kornea yaralanmaları çeşitlidir, ama büyük ölçüde toz veya kum, çizilme veya diğer yabancı nesneler gibi küçük parçacıklar tarafından kaynaklanır. Protokol tanımlamak burada kornea epitel aşınma klinik bir tür üreyen amaçlamaktadır. Bunu yaparken, bu iletişim kuralı klinisyenler ve kornea bilim adamları kendi çalışmaları uygulamak için bir kontrol edilebilir ve seminal yöntemi sağlar. Biz fare kornea üzerinde doku dulled oküler burr, Algerbrush II ile aşındırma tarafından bir vivo içinde hasar onarım tahlil gerçekleştirdiniz. Burada, biz sadece merkezi kornea epitel için aşınma hedef ve organ zarar vermeden diğer bölgelerinde bırakın. Böylece, iletişim kuralını yeniden epithelialization sırasında çalışma kornea epitel hücre dinamiği veya membran için idealdir geçiş, yayılmasını önleme ve farklılaşma vivo içinde5hücre. Son zamanlarda, bu model fare kornea de kapasite kornea kök hücre niş yaralanma6,7‘ den sonra yeniden kurulmasında farklılaştırılmış kornea epitel hücresi açıklayacak olarak progenitör hücre dinamiklerini analiz etmek için kullanıldı. Aşınma, korneanın normal şeffaflık ve çekme dayanımı için döndürür. İlginçtir, bir vitro çalışma artan hücre proliferasyonu8yeniden o epithelialization oluşur göstermiştir. Bu iletişim kuralı kesintisiz fare kornea iyileşme zaman çizelgesi açıklar. Yöntem böylece şifa desenleri ve hız üzerindeki etkisi ilaç test etmek için geçerlidir.
Kornea kapsamlı çalışmalar şifa yara için kullanılmıştır. Ancak, birçok çalışma yaralanma diğer modellerde yararlanmıştır. Bir iyi kurulmuş kornea yaralanma sodyum hidroksit (NaOH) uygulayarak gerçekleştirilir alkalin yanık veya filtre kağıdı kornea yüzey9olmadan modeldir. Alkali pozlama sadece kornea epitel, aynı zamanda konjonktiva ve stroma9,10etkiler büyük ve diffüz yaralanma içinde sonuçlanır. Güçlü alkalin çözümleri kornea ülseri, opaklaşmasına ve neovaskülarizasyon9ikna etmek için gösterilmiştir. İnflamatuar hücre genellikle içinde 6 h stroma istila ve 24 saat11‘ e kadar orada kalır. Böylece, alkali yaralanması stromal harekete geçirmek ile ilgili çalışmalarda tavsiye bir yöntemdir. Başka bir tür kimyasal yaralanma dimetil sülfoksit (DMSO) uygulayarak üstünde kornea9,10uyguluyor. Diğer sık kullanılan yaralanma modelleri stroma14,15üst bölümü sınırlıdır stroma ve keratectomy yaralar üzerinden nüfuz umblikal yaralar içerir. Bu yöntemleri de stromal yara iyileşmesi ile ilgili soruları cevaplamak yararlıdır. Farklı yaralanma modelleri kendi avantaj ve dezavantajları vardır. Aşınma veya debridman, kornea epitel, ilk neşter dulled veya bıçaklar ex vivo kornealar16tarihinde kullanarak geliştirilmiştir. Bu yöntem daha sonra kullanılan vivo içinde fare, fare ve tavşan17,18,19,20,21,22üzerinde olmuştur. Oküler burr (Şekil 1) kullanarak, epitel kalan etkilenmez bırakarak epitel, yalnızca seçili bir bölge kaldırın. Bu şekilde, tam olarak farklı bölgelerine kornea epitel kaldırma hedeflemek mümkündür. Buna ek olarak, aşınma boyutu floresein boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, burada aşınma kapatma sırasında iyileşme dönemi takip ediyoruz.
Bu yöntem birçok avantaj teşkil etmektedir, i) dahil olmak üzere tam yerini kimyasal yaralanma ile mümkün değildir, aşınma sitesinin II) aşınma gerçekleştirmek hızlı, ve III) Bu non-invaziv. Burada, bu fare genetik modellerini geniş dizi yanı sıra sıçan ve insan kornea bozulma eğitim için kullanılan ortak modellerdir tavşan uygulanan olabilir ancak bir model olarak outbred NMRI fareyi kullanarak yöntemi açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaralama yöntemleri kornea homeostazı ve patolojileri farklı yönlerini incelemek için popüler araçlardır. Aşınma modeli Oftalmoloji ilgili sorunları çözmek için iyi kontrollü bir yöntem sunar. Ancak, bazı kritik noktaları iletişim kuralındaki vurgulayan değer vardır. Özellikle, belirlenen veteriner ilaçları, yara iyileşme zaman çizelgesi ve sonucu ile ilgili ayrıntıları outbred NMRI ve ICR stokları ile kullanım için optimize edilmiştir, ama fareler26suşları aras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kaisa Ikkala onun çok değerli teknik yardım ve ne zaman bu yöntem gerçekleştirirken anlayışlı yardım yanı sıra daha sonra sırasında uygulama bizim Merkezi araştırma soruları için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca laboratuvar hayvan merkez ve Anna Meller veterinerlik eser yönergeleri planlama konusunda ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -. K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- . Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018)
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
