Opgraving van plantenwortels uit het veld en verwerking van de monsters in endosphere, rhizosfeer en bodem worden in detail, met inbegrip van DNA-extractie en gegevens analysemethoden beschreven. Dit document is bedoeld om andere laboratoria maken gebruik van deze technieken voor de studie van de bodem, endosphere en microbiomes van de rhizosfeer.
Plant en bodem microbiome studies zijn steeds belangrijker voor de micro-organismen van de rollen in landbouwproductiviteit spelen begrip. Het doel van dit manuscript moet detail geven over hoe snel genieten van de bodem, de rhizosfeer, en endosphere van gerepliceerde veldproeven en analyseren van wijzigingen voordoen bij de microbiële gemeenschappen als gevolg van monster type, behandeling en plant genotype. Het experiment gebruikt om aan te tonen deze methoden bestaat uit gerepliceerde veld percelen met twee, zuiver, warm-seizoen grassen (Panicum miliaceum en Andropogon Rus) en een lage-diversiteit gras mengsel (A. Rus, Sorghastrum Vogelmelk, en Bouteloua curtipendula). Kort, planten zijn opgegraven, een verscheidenheid van wortels zijn gesneden en geplaatst in fosfaatbuffer en geschud voor het verzamelen van de rizosfeer. Wortels worden gebracht naar het laboratorium op ijs en oppervlak gesteriliseerd met bleekmiddel en ethanol (EtOH). De rizosfeer is gefilterd en geconcentreerd door middel van centrifugeren. Afgegraven grond van rond de wortel bal is geplaatst in plastic zakken en gebracht naar het lab waar een kleine hoeveelheid bodem is genomen voor DNA extracties. DNA is gewonnen uit de wortels en bodem rhizosfeer en vervolgens versterkt met inleidingen voor de V4-regio van het 16S rRNA gen. Waarbij sequenced, dan geanalyseerd met open toegang bioinformatica tools. Deze methoden toestaan van onderzoekers om te testen hoe de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling varieert vanwege monster type, behandeling, en plant genotype. Met behulp van deze methoden samen met statistische modellen blijkt de representatieve resultaten er aanzienlijke verschillen in microbiële gemeenschappen van wortels, rhizosfeer en bodem. Methoden die hier gepresenteerd bieden een complete set van stappen voor het verzamelen van veldmonsters, isoleren, uitpakken, kwantificeren, versterken, en DNA-sequentie en analyseren van de microbiële Gemeenschap diversiteit en samenstelling in gerepliceerde veldproeven.
Microbiome onderzoek heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen en manipuleren van ecosysteem processen zoals nutriënten fietsen, organisch materiaal omzet, en de ontwikkeling of remming van de bodem ziekteverwekkers1,2. Dit onderzoeksgebied houdt ook groot potentieel voor het begrijpen van de effecten van bodem-microben op de productiviteit van natuurlijke plantaardige Gemeenschappen en agro-ecosystemen. Hoewel er veel studies die zijn gericht op de microbiome van de bodem in natuurlijke ecosystemen, hebben minder gericht op plant rhizosfeer en endosphere microben in agro-ecosystemen3. In Nebraska domineert landbouw het landschap in grote delen van de staat, de studies van deze bodems maken waar agrarisch belangrijke gewassen een cruciaal onderwerp voor onderzoek worden gekweekt. Het doel van deze paper methoden is om onderzoekers te voorzien van een standaardset van protocollen bij het beschrijven van de microben aanwezig zijn in de agro-ecosystemen, om te bepalen hoe de plantenwortels de microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer en endosphere, en uiteindelijk wijzigen begrijp de functies die deze microben in bodem sanitaire en fytosanitaire productiviteit spelen.
De methode die hier wordt gepresenteerd verschilt enigszins van de methoden die worden gebruikt door anderen4,,5 , in dat dit document is gericht op het leren welke microben zijn uitsluitend binnen de wortel en hoe ze verschillen van microben onmiddellijk buiten de root in de rhizosfeer. De volgorde van de amplicon gebruikt in deze studie identificeert de microbiële taxa gevonden in het DNA-monster en laat onderzoekers om te bepalen hoe de gemeenschappen afhankelijk van monster type of behandeling veranderen. Een van de belangrijkste verschillen tussen dit protocol en een zeer vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt door Lundberg et al. 6 is dat in plaats van ultrasoonapparaat, dit protocol oppervlakte sterilisatie met bleekmiddel en ethanol gebruikt om de rizosfeer van de wortels. Anderen hebben ook gebruik gemaakt van oppervlakte sterilisatie effectief7,8,9,10. Deze methoden zijn niet voordeliger dan andere methoden, maar iets anders. Deze methoden zijn bijzonder goed geschikt voor grote veld experimenten, want met genoeg mensen is het mogelijk voor het verwerken van meer dan 150 veld percelen per dag, waardoor maximaal ongeveer 450 monsters als gepartitioneerd in endosphere, rhizosfeer en bodem. Dit manuscript beschrijft in detail de gebruikte methoden voor proeven in het veld, het verwerken van het materiaal in het lab, uittreksel en de DNA-sequentie, en biedt een beknopt overzicht van de stappen om de resulterende rangschikken gegevens te analyseren.
De methoden die worden beschreven in dit manuscript moeten inschakelen wetenschappers om gemakkelijk het gebied van bodem en plant metagenomics. Door de jaren heen, hebben wij onze methodes verfijnd sinds het uitvoeren van het experiment beschreven in dit manuscript. Één verandering is dat we nu vooraf label buizen voor het uitgaan naar het veld te monster. Onze afwerkcentrale gebruikt een barcoding-systeem en een labelprinter. De labelprinter bespaart niet alleen tijd toen labeling buizen, maar ook maakt alles makkelijker bijhouden en monsters zonder de grillen van menselijke hand schrijven correct te herkennen. Een ander belangrijk punt is dat we proberen te verwerken van het materiaal na brengen het terug uit het veld zo spoedig mogelijk. Wij streven ernaar om te bevriezen van de bodem gebruikt voor DNA-analyse, steriliseren en bevriezen van de wortels, en filteren en blokkeren de rizosfeer binnen 12 tot 36 uur na zijn terugkeer uit het veld. De DNA-extractie-procedures zijn langdurig met veel stappen, met name voor de bodem en de rhizosfeer, dus we een robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) die minimaliseert de handen op tijd voor de protocollen van de extractie van DNA kochten, vermindert menselijke fout die kan worden ingevoerd, en verbetert de consistentie in de manier waarop verschillende batches van bodem, wortels of rhizosfeer worden verwerkt. Bij het werken met plantaardig materiaal is het belangrijk om te beslissen over het type root te worden bestudeerd of te nemen van een verscheidenheid van wortel types te krijgen van een “representatief”. Behoud van wortels en bladeren in een bevroren toestand bij het uitvoeren van de DNA-extracties zoals is het belangrijk is ervoor te zorgen is er geen kruisbesmetting tussen de monsters bij het invullen van de 96-Wells DNA-extractie-platen. Een andere belangrijke factor die meespeelt is het aantal replicatieonderzoeken moet worden gebruikt wanneer het veld experimenten ontwerpen en gebruiken van een complete gerandomiseerde ontwerp waar mogelijk26. Als gevolg van de variabiliteit van de hoge veld het mogelijk moet zijn een groot aantal wordt gerepliceerd naar het detecteren van kleine verschillen. Tot slot, uit onze ervaring het is essentieel om ervoor te zorgen dat bodems zijn niet te nat. Wanneer het opgraven van de wortels. Als de bodems zijn verzadigd met water het is niet alleen rommelig om mee te werken, maar het is ook zeer moeilijk te bepalen van de rhizosfeer en te verwijderen van de bodem van de wortels.
Een wijziging die werd gemaakt al vroeg tijdens de ontwikkeling van deze methoden is in plaats van het schudden van de buizen met de hand om de rizosfeer die we opgewaardeerd tot vortexers aangedreven door een gas generator om het werk gemakkelijker in het veld en meer gestandaardiseerd in termen van de tijd en de wijze dat elke buis werd geschud. Een beperking van de amplicon rangschikking aanpak is dat de resolutie van de taxonomische van de resultaten vaak beperkt is en vele OTUs onbekende of enige bekende op de familie of een genus niveau zijn. Dit veld van onderzoek evolueert snel dus is het belangrijk op de hoogte van nieuwe en ontwikkelende benaderingen, met name voor data-analyse die de resolutie van de resultaten kan verbeteren.
Deze protocollen zijn alleen voor het studeren niet schimmels, bacteriën en archaea. Het gebruik van verschillende inleidingen voor versterking zal toestaan voor de studie van fungale gemeenschappen met behulp van de dezelfde DNA monsters27,–28. Deze methoden vereisen niet de aankoop van grote hoeveelheden materiaal omdat de methoden kunnen worden vereenvoudigd. De methoden die we beschrijven hier zijn voornamelijk voor het bepalen van de “wie is er”, maar het veld snel ontwikkelt zich tot een belangrijke vragen over de functie, die kan worden aangepakt met behulp van shotgun sequencing methoden, isolatie en testen van de functionaliteit van microben, of de hele microbiële genoom sequencing.
De representatieve resultaten benadrukken de verschillen in microbiële gemeenschappen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de beschreven methoden. Met behulp van een bèta-diversiteit benadering de data analyse22, werden samenstelling verschillen tussen monster types getoond. Deze verschil zijn in de meeste andere studies waar endosphere, rhizosfeer en bodem bevatten unieke microbiële gemeenschappen3duidelijk waargenomen. Het indexcijfer van de diversiteit van de Shannon was berekend de overvloed en de gelijkmatigheid van de microbiële soorten waarvan de aanwezigheid binnen iedere plantensoorten in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem te bepalen. Zoals u in deze studie en vele anderen, is Alfa diversiteit het hoogst in de bodem, licht dalend in de rizosfeer en dan daalt aanzienlijk in de endosphere3,5,29. Deze resultaten wijzen erop dat de hier beschreven methoden geschikt zijn voor het identificeren van compositorische wijzigingen in de endosphere, de rhizosfeer, en de bodem.
De dominantie van de Proteobacteria is een gemeenschappelijke vaststelling in studies over endosphere en bodem30,31,32. Endosphere heeft over het algemeen een lagere diversiteit van microbiële soorten met een hogere relatieve abundantie van de Proteobacteria. Hieruit blijkt opnieuw dat de resultaten hier representatief voor andere bevindingen in de literatuur zijn. De effecten van de behandeling in deze studie waren niet significant verschillend en twee grote redenen daarvoor kunnen worden dat de verschillen die zijn opgelegd door de behandelingen niet groot genoeg is waren voor het genereren van voldoende variatie om op te sporen en dat deze bemonstering werd gedaan aan het einde van de groeiseizoen, wanneer de velden kunnen hebben voldoende tijd gehad om te vestigen beneden de stikstof op vergelijkbare niveaus, die is wat werd gemeten aan het eind van het seizoen. In een andere studie met behulp van soortgelijke bevruchting tarieven over een langere periode van tijd, werden slechts relatief kleine veranderingen in de samenstelling van de microbiome gemeten33. Andere studies hebben aangetoond wijzigingen in zowel schimmel en bacteriële gemeenschappen als gevolg van stikstof kunstmest34,35.
Plantensoorten zijn gekend om te spelen een rol bij het bepalen van hun microbiomes3,32,36 en zelfs kleine verschillen in de variant van de microbiële Gemeenschap zijn aangetoond tussen verschillende plant genotypen binnen een enkele soorten37. In deze studie werd een significant verschil in samenstelling van de microbiële Gemeenschap gevonden tussen plantensoorten. In alle soorten van de steekproef bleek dat switchgrass had de meest verschillende microbiële samenstelling, maar waren de verschillen tussen soorten alleen statistisch significant in de endosphere. Rhizosfeer Gemeenschap samenstelling kan beduidend indien meer replicatieonderzoeken beschikbaar voor analyse waren zijn geworden.
De gecombineerde veld, lab en analytische protocollen beschreven hier bieden een krachtige methode voor het bestuderen van de manier waarop de verschillende factoren invloed de samenstelling van microbiële gemeenschappen in bodem, rhizosfeer, en de endosphere van wortels36. Er is een heleboel werk te doen op het gebied van het bestuderen van de microbiomes, met name in agrarische velden. Belangrijke vragen op over hoe de opbrengsten worden gewijzigd door de microbiome van de bodem moeten nog volledig worden opgehelderd. Zelfs de meest elementaire vragen over hoe vruchtwisseling invloed op de microbiome van de bodem, hoe timing verandert de microbiome, hoe abiotische stress verandert de microbiome, hoe bodemtype interageert met deze factoren te wijzigen van de microbiome, en of er universele microben in bepaalde gewassen of regio’s van de VS zijn allemaal open vragen. Deze methoden zullen ook nuttig voor epidemiologisch onderzoek om de aanwezigheid en de persistentie van pathogene en gunstige bacteriën te identificeren. Een andere toekomstige horizon voor deze methoden zullen om te beginnen met de hier beschreven met plant- en microbe RNA- en metaboliet gegevens DNA-methoden te integreren. Extra verbetering en het testen van meer variabelen is belangrijk voor verdere optimalisatie van deze protocollen.
The authors have nothing to disclose.
De ontwikkeling van dit manuscript wordt ondersteund door de National Science Foundation EPSCoR Center voor Root en Rhizobiome innovatie Award OIA-1557417. Het verzamelen van gegevens werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln, landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling en door een subsidie van de Hatch van USDA. Wij erkennen ook steun van de USDA-ARS en ondersteuning werd verstrekt door de landbouw en voedsel onderzoek initiatief concurrerende Grant nr. 2011-68005-30411 van de USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw te richten en te beheren van deze velden.
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |