Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.
Uma vasta gama de estudos em biologia vegetal são executadas utilizando culturas hidropônicas. Neste trabalho, é apresentado um sistema hidropônico crescimento em vitro concebido para avaliar as respostas de fábrica de produtos químicos e outras substâncias de interesse. Este sistema é altamente eficiente na obtenção de mudas saudáveis e homogêneas do C3 e C4 modelo espécies Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, respectivamente. O cultivo estéril evita algas e contaminação de microorganismos, que são conhecidos fatores limitantes para o crescimento normal da planta e desenvolvimento em hidroponia. Além disso, este sistema é escalável, permitindo a colheita de material vegetal em grande escala com pequenos danos mecânicos, bem como a colheita de peças individuais de uma planta, se desejado. Um protocolo detalhado, demonstrando que este sistema tem uma montagem fácil e de baixo custo, como ele usa a pipeta cremalheiras como a plataforma principal para o cultivo de plantas, é fornecido. A viabilidade deste sistema foi validada utilizando mudas de Arabidopsis para avaliar o efeito da droga AZD-8055, um inibidor químico do alvo da rapamicina (TOR) quinase. Inibição de TOR eficientemente foi detectada logo em 30 min depois de um tratamento de AZD-8055 em raízes e brotos. Além disso, plantas de AZD-8055-tratados exibido o fenótipo de amido-excesso esperado. Propusemos este sistema hidropónico como um método ideal para pesquisadores de planta com o objetivo de monitorar a ação da planta indutores ou inibidores, bem como avaliar fluxos metabólicos usando isótopos-rotulagem compostos que, em geral, requer o uso de caro reagentes.
As vantagens de crescer plantas usando hidroponia tem sido amplamente reconhecidas na produção de plantas grandes e uniformes, possibilitando experiências reprodutíveis1,2,3. Neste sistema, a composição da solução nutritiva pode ser adequadamente controlada e reciclada ao longo de todas as fases de desenvolvimento e crescimento das plantas. Além disso, as raízes não estão sujeitos ao estresse abiótico, como pode acontecer em plantas de solo cultivado, como nutriente fome e água deficiência4. Como as plantas crescidas hydroponically presentes morfológicas e fisiológicas características bastante semelhantes da cultivadas no solo, este sistema tem sido amplamente empregado em pesquisa porque permite o acompanhamento do crescimento da raiz/fotografar e sua colheita sem lesões de2,5.
Devido à possibilidade de alterar a composição e a concentração da solução nutritiva, a maioria da pesquisa usando condições hidropônicas tem sido realizado para caracterizar as funções de micro e macronutrientes1,3 ,6,7,8. No entanto, este sistema provou para ser muito útil para uma ampla gama de aplicações em biologia vegetal, tal como para elucidar as funções dos hormônios e substâncias químicas em plantas. Por exemplo, a descoberta de estrigolactonas como uma nova classe de hormônios9 e o fenótipo de crescimento acelerado, desencadeada por brassinosteroid aplicação10 foram realizadas em condições hidropônicas. Além disso, este sistema permite experimentos com isótopos rotulados (por exemplo, 14N /15N e 13CO2)11,12 , para avaliar sua incorporação de proteínas e metabólitos por espectrometria de massa.
Considerando a importância deste sistema na pesquisa da planta, foi projetado um elevado número de culturas hidropônicas nos últimos anos, incluindo sistemas que usam a (i) a transferência de mudas de placas para recipientes hidropônico3, 13; (ii) rockwool que limita o acesso aos estágios iniciais de desenvolvimento do raiz2,14,15; (iii) polietileno granulado como o corpo flutuante, o que torna a aplicação homogênea de pequenas moléculas/tratamentos difíceis16; ou (iv) um reduzido número de plantas9,17. O volume dos tanques hidropônicos descrito em muitos desses protocolos são geralmente grandes (pequenos volumes que variam de 1 a 5 L, até 32 L)18, que faz a aplicação de produtos químicos extremamente caro. Embora alguns estudos descrevem um cultivo hidropônico sob condições assépticas8,19, a montagem do sistema é geralmente bastante trabalhoso, consistindo o ajuste perfeito de malhas de nylon em plástico ou vidro recipientes de5,8,17,20.
Devido à importância de Arabidopsis thaliana como uma planta modelo, a maioria dos sistemas de hidroponia foram projetada para esta espécie1,2,8,14,18, 19 , 20. no entanto, existem poucos estudos relatando as características de crescimento hidropônico de outras espécies de plantas com um pré-tratamento de sementes para melhorar sua germinação e taxas de sincronização em vitro8,16 . Para trabalhar em grande escala, desenvolvemos um protocolo para a criação de um sistema hidropónico manutenção simples e de baixo custo que permite condições estéreis para o cultivo de plantas, incluindo a. thaliana e outras espécies, como a grama Setaria viridis. O método descrito aqui é apropriado para experiências diferentes, como o crescimento do seedling pode ser maximizado, sincronizado e facilmente controlado. Além disso, este sistema tem muitas vantagens como: (i) a sua montagem é simples e seus componentes podem ser reutilizados; (ii) permite a fácil aplicação de produtos químicos diferentes para o meio líquido; (iii) as mudas germinam e crescem diretamente no meio de cultura sem a necessidade de transferência para o sistema de hidroponia; (iv) o desenvolvimento/crescimento atirar e raiz pode ser estreitamente vigiado e as mudas são colhidas sem danos; e (v) torna possível trabalhar em grande escala, mantendo condições fisiológicas.
Essa estrutura hidropônica otimizada permite a cultura de sucesso em vitro de plantas. As sementes germinam bem sobre o meio sólido na superfície plana de ponta de pipeta, um ganho considerável em comparação com sistemas onde as sementes estão encharcadas com a solução nutriente. Uma grande vantagem deste sistema é que durante o desenvolvimento das mudas, raízes diretamente em contato com o meio líquido sem a necessidade de transferência. Além disso, tratamento químico pode ser facilmente aplicado…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa de São Paulo (FAPESP; Conceder 12/19561-0) e a sociedade Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) é grato para as bolsas. Os autores agradecer Christian Meyer do Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, França) generosamente fornecendo anticorpos contra RPS6. Os autores agradecer RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza, pelo apoio técnico durante o áudio de gravação.
Ethanol | Merck | 100983 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
Hotplate | AREC | F20510011 | |
Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |