Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.
Es una preocupación importante en Neurociencia cómo diferente tipos de neuronas funcionan en circuitos neurales. Los avances recientes en optogenetics han permitido la identificación del tipo neuronal en vivo experimentos electrofisiológicos en regiones amplias del cerebro. En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Sin embargo, a menudo es difícil entregar la luz del estímulo a las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Aquí, describimos un método para registrar respuestas de espiga a la luz de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en las regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.
El sistema nervioso central consta de varios tipos de neuronas, que tienen diferentes funciones. Cómo funcionan estos tipos de neuronas dentro del circuito neural es una de las preocupaciones principales de la neurociencia. Sin embargo, en muchas regiones del cerebro, ha sido imposible distinguir los tipos neuronales en grabaciones en vivo de actividades eléctricas porque no hay clara diferencia en la señal de punto eléctrico, con algunas excepciones. Los avances recientes en optogenetics han hecho un gran avance1,2. Uso de animales transgénicos que sensibles a la luz opsina (p. ej., channelrhodopsin-2) se expresa en tipos neuronales específicos, llegó a ser posible distinguir los tipos neuronales eficientemente en vivo grabaciones3, 4,5,6. En estos animales se excitan las neuronas con sensibles a la luz opsina dando estímulos de luz durante las grabaciones eléctricas, pero otras neuronas no son. Las neuronas de la opsina-positivo, por lo tanto, se distinguen fácilmente de otros tipos de neurona por sus respuestas a la luz.
En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Como un método no invasivo, la luz es dirigida a menudo de la superficie del cerebro. Sin embargo, porque la fuerza de la luz reduce ya que pasa a través de tejido fino del cerebro, es difícil estimular las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Experimentos electrofisiológicos a menudo se han realizado en animales anestesiados ya que el movimiento del cuerpo hace ruido en las grabaciones. Como está bien documentado, sin embargo, la anestesia es conocida por cambiar las respuestas neuronales7,8,9,10. Por lo tanto, es necesario utilizar animales despiertos para estudiar las respuestas neuronales sin el efecto artificial de la anestesia. A diferencia de los experimentos con animales anestesiados, las grabaciones electrofisiológicas se realizan después de la recuperación de la cirugía en los experimentos con animales despiertos. Durante el intervalo entre la cirugía y las grabaciones, el exudado del tejido a menudo se acumula en la superficie del cerebro y hace poco la transparencia óptica de la superficie del cerebro.
Aquí, describimos un método para registrar grabaciones de una sola unidad de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.
Optogenetics se ha convertido en una herramienta poderosa en la neurociencia. Se ha utilizado para identificar tipos específicos neuronas en vivo así como manipular las actividades de vías neuronales específicas. La clarificación de las actividades neuronales de diferentes tipos neuronales promueve la comprensión del mecanismo de los circuitos neuronales. Aquí, hemos demostrado un método para proporcionar la luz en el sitio de grabación a través de un electrodo de vidrio en el IC de despiertas ratones …
The authors have nothing to disclose.
Los autores fueron apoyados por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia KAKENHI Grant JP16K11200 y 17H 02223 y la subvención para la investigación de Kanazawa médica Universidad S2016-8 y C2017-3. Damos las gracias por su apoyo en la toma de las fotos Yuhichi Kuda.
Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |