단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이
Summary
설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.
Abstract
단일 세포 분석은 세포의 이종 인구를 해 부하는 중요 한 도구 이다. 식별 및 희귀 세포의 격리 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 방법론 결합 인덱스 cytometry 고 높은 처리량 다중화 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 개발 되었다. 목표를 식별 하 여 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)의 특성은-붉은 털 원숭이 내의 세포를 감염. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)에 의해 표면 단백질의 정량에 의해 mRNA 정량를 통해 바이러스에 감염 된 세포는 다차원 프로필을 만들 호스트 유전자와 단백질 측정 함께 바이러스 성 유전자 발현에 의해 식별 됩니다. . 우리 용어 접근, 타겟된 단일 셀 Proteo transcriptional 평가, 또는 tSCEPTRE. 메서드를 수행 하기 위해 실행 가능한 세포 표면 마커 FACS 절연 셀 집합 또는 다운스트림 phenotypic 분석의 사용에 대 한 특정 형광 항 체와 스테인드는. 단일 셀 뒤에 즉시 세포, 다중 반전 녹음 방송 (실시간), PCR 사전 확대, 및 최대 96 성적 높은 처리량 정량 정렬 됩니다. FACS 측정 정렬의 시간에서 기록 하 고 이후 transcriptional 프로필 및 결합된 단백질을 만드는 좋은 위치에 의해 유전자 표현 데이터에 연결 됩니다. SIV에 감염 연구를 직접 ex vivo세포, 세포는 여러 바이러스 RNA의 정량 검출에 의해 확인 되었다. 바이러스 성 성적표의 조합과 각 양의 바이러스 성 수명 주기 (예를 들어, 비 생산적 대 생산)의 단계로으로 세포를 분류 하기 위한 프레임 워크를 제공 합니다. 또한, SIV+ 세포의 tSCEPTRE 감염에 비해 셀 차동 표현된 호스트 유전자와 단백질을 평가 하기 위해 동일한 견본에서 고립 되었다. 분석 감염 된 세포 뿐만 아니라 vivo에서 단일 셀 해상도 post-transcriptional 유전자 SIV 중재 규정 중 이전 진가 바이러스 성 RNA 식이 밝혔다. TSCEPTRE 메서드는 의무가 표면 단백질 marker(s), 호스트 또는 병원 체 gene(s), 또는 그것으로 조합 식으로 식별 된 셀 인구의 분석입니다.
Introduction
종종 호스트 세포 생물학 변경 또는 전파의 그들의 기회를 극대화 하기 위해 호스트 세포의 매우 구체적인 부분 모집단을 대상으로 많은 세포내 병원 체 복제 호스트 셀 기계에 의존 합니다. 그 결과, 세포 생물학 프로세스는 일반적으로 중단, 호스트의 전반적인 건강에 해로운 결과. 바이러스 및 그들은 복제 하는 있는 호스트 세포 사이 상호 작용 이해 감염을 방지 하기 위해 향상 된 치료 및 전략의 개발에 도움이 있습니다 질병 메커니즘 명료 하 게 됩니다. 호스트 병원 체 상호 작용의 연구를 직접 분석 도구는이 필수적입니다. 단일 세포 분석은 명확 하 게 특정 유전자 형 또는 감염 상태1세포 표현 형을 특성에 유일한 수단을 제공 합니다. 예를 들어 병원 성 감염 자주 호스트 세포에서 둘 다 직접 및 간접 변화 유도. 따라서, 구별 그들의 감염에서 감염 된 세포는 직접 감염 또는 보조 효과 특성 호스트 셀 변경 하는 데 필요한 같은 일반화 된 염증. 또한, 많은 병원 체, SIV와 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 같은 일찍, 늦게, 호스트 세포 감염 같은 여러 단계를 통해 진행 또는 숨겨진, 각각의 특징 수 있습니다 고유한 유전자와 단백질 표정 단면도2 , 3 , 4 , 5. 세포 혼합물의 대량 분석이이6을 잡으려고 실패 합니다. 대조적으로, 매우 둘 다 바이러스의 식 계량 수 단일 세포 분석 다중화 하 고 감염 관련 세포 섭, 감염 단계에 걸쳐 변화를 포함 하 여 해결 하는 수단을 제공 하는 호스트 유전자. 또한, 순수에 호스트 병원 체 상호 작용 분석 관련 설정을 감염 된 유기 체에서 발생 하는 이벤트의 식별을 위해 중요 합니다. 따라서, vivo ex vivo에서 최고의 가능성이 캡처는 직접 적용할 수 있는 방법을 처리 합니다.
SIV와 HIV CD4 대상+ T는 그들이 중화 호스트 항 바이러스 “제한” 요소와 downregulate 항 원 제시 하는 생산적인 감염 고 방지 면역 감시7,8, 분자 세포 9,,1011. 치료를 하지 않으면 감염 c d 4의 대규모 손실에 결과+ T 세포, 궁극적으로에 culminating 획득 면역 결핍 증후군 (에이즈)12. 투여 요법의 설정에서 latently 감염된 세포 저수지 치료 전략에 강한 장벽 포즈, 수십 년 동안 지속. Vivo에서 HIV/SIV에 감염 된 세포의 속성을 이해 pathogenesis 및 지 속성에 호스트 세포 기능을 가능성이 있다. 그러나, 이것은 매우 도전, 감염 된 세포의 low frequency 그리고 그들을 쉽게 식별할 수 시 약의 부족 때문에 주로. 바이러스 성 RNA 녹음 셀 0.01-1에 있기 위하여 견적 된다 CD4의 %+ T 세포가 혈액과 림프 조직13,,1415에. 진압 치료에서 latently 감염 된 세포는 10-3– 10-7- 16,,1718도 덜 자주. 체 외에 감염, 같은 세포내 개 그 공부 잘 작동 배경 0.01-0.1의 얼룩 때문에 차선은 분석 실험 바이러스 성 단백질 얼룩 %, 감염 된 세포13의 주파수 보다 작거나 비슷합니다 14. 잘 특징이 SIV/에이즈 환경을 특정 단일 클론 항 체를 사용 하 여 환경 단백질에 대 한 표면 얼룩 또한 입증 되었다 어려울, 아마 유사한 이유를 위해. 최근, 새로운 도구 중 개 그를 표현 하는 세포의 탐지를 향상을 목표로 통합 개 그 RNA 또는 대체 이미징 기술14,,1519를 사용 하 여 특정 분석 실험. 그러나, 이러한 접근 제한 남아 양적 측정 수에서 각 셀에서 수행.
여기, 우리 (1) 직접 비보 전 과민 하 고 특정 바이러스 성 유전자 정량 정량 및 (2) 각 감염에 대 한 최대 18 표면 단백질 및 96 유전자의 식을 단정 단일 바이러스에 감염 된 세포를 식별 하는 방법 설명 (그리고 감염 되지 않은) 셀입니다. 이 방법론은 FACS 즉시 세포 세포의 용 해에 의해 다음에 의해 단일 세포 표면 단백질 측정 그리고 Biomark 시스템에 대상으로 정량 멀티플렉스 유전자 표정 분석 사용 하 여. 통합된 유체 회로 (IFC) 기술 수 있습니다 96 샘플에서 96 유전자의 멀티플렉스 정량을 동시에 개별 정량 Pcr 반응을 수행 됩니다 9,216 챔버의 매트릭스에 의해 수행. 즉시 수행 분석에 대 한 전체 transcriptome 보존 하는 동안이 콘텐츠 단백질 풍부한 측정 기록 라이브 셀 FACS 정렬 다운스트림. 바이러스에 감염 된 세포를 식별, 양자 택일로 접합 하 고 unspliced 바이러스 성 RNAs (vRNA)에 대 한 분석 실험 관련 최대 96 유전자, 현재에 수용 하는 분석 실험의 최대 수를 총 사용자 정의 분석 실험의 패널 함께 정량 분석에 포함 IFC입니다. 유전자 발현 및 단백질 정보 각 셀에 대 한 좋은 위치에 의해 연결 됩니다. 우리는 이전20이 분석을 다른 곳에서 결과 보고 했다. 여기, 우리는 자세한 SIV에 감염 된 CD4의 추가 설명 형질으로 서 방법론 지침 제공+ T 세포.
우리 tSCEPTRE 기간,이 접근의 어떤 가능한 셀 붙일 레이블된 항 체를 표현 transcriptome 호환 가능한 정량 분석 실험 반응 정지에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 차동 유전자와 단백질 표정 희귀 세포 또는 세포 표면 단백질 마커에 의해 쉽게 구별 특성화에 대 한 사용할 수 있습니다. 샘플 준비는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 표준에 의존 합니다. 단일 셀 정렬 기능 Cytometers 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다, 하지만 추가 biosafety 예방 감염 라이브 셀을 처리 하는 데 필요한. 여기 라고 잘 위치 하 여 각 셀에 대 한 단일-셀 단백질 식 프로필 기록 분류, 색인으로 정렬 소프트웨어 상용 FACS의 일반적인 기능입니다. 관심의 셀 인구 가운데 차동 표현된 호스트 유전자의 전산 분석, 설명 되지 않은 하지만 참조는 이전에 게시 방법에 제공 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 여기에 설명 된, tSCEPTRE 되 나, 높은 다중화 실시간 정량 Pcr에 의해 양적 단일 셀 mRNA 식 multiparameter cytometry에 의해 통합 하는 단일 세포 표면 단백질 정량. 이 두 기술의 조합 transcriptional는 결합의 높은 콘텐츠 스냅샷 및 높은 처리량 형식에서 단일 세포의 단백질 프로필 수 있습니다. 우리는 메서드를 사용 하 여 지금까지 애매 셀 SIV에서 vivo에서, 감염을 식별 하 고 차동 표현된 호?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NIAID VRC Flow Cytometry 코어와 MHRP Flow Cytometry 핵심 시설 유지 보수 및 FACS 악기와 정렬 장비 운영에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 마리아 몬테, Vishakha Sharma, Kaimei 노래 전문가 기술 지원; 마이클 Piatak, 주니어 (고 인)를 통해 SIV 정량 분석 결과 디자인; 브랜든 킬와 SIV에 대 한 매튜 Scarlotta 시퀀스를 분리 하 고. 표현 그 저자 고 미 육군 또는 국방부의 위치를 나타내는 해석 되어서는 안 됩니다. 연구 동물 복지 행위 및 다른 연방 법령 및 동물에 관련 된 규정 준수는 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 의정서 실시와 관련 된 동물 실험 원칙을 준수 관리 및 실험 동물의 사용, NRC 게시, 2011 년 판에 대 한 가이드에 명시 된.
Materials
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RNA extraction and PCR reagents and consumables |
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Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
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Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
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|
Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
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MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
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DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
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Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
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Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
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SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
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|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
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DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
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RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
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TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
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CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
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TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
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|
Biomark reagents |
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|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
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|
Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
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|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
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Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
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FACS reagents |
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SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
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|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
|
Instruments |
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BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
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BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
|
Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
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