Summary

Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем два протокола для изучения фагоцитарной –Mycobacterium abscessus взаимодействий: скрининга мутантов библиотеки transposon для бактериальных внутриклеточный дефицит и определение бактериальной внутриклеточных транскриптом от РНК последовательности. Оба подхода обеспечивают проницательность в геномной преимущества и транскриптомики приспособления, повышения фитнес внутриклеточных бактерий.

Abstract

Что отличает от других сапрофитные микобактерий Mycobacterium abscessus является способность противостоять фагоцитоза макрофагами, человека и способность размножаться внутри таких клеток. Эти черты вирулентности оказывают м. abscessus патогенных, особенно в уязвимых хостов с базовых структурных легочных заболеваний, таких, как муковисцидоз, бронхоэктатическая болезнь или туберкулезом. Остается неясным, как больных инфицируются м. abscessus . В отличие от многих микобактерий м. abscessus не найдены в среде, но могут находиться внутри амёб, экологические фагоцитов, которые представляют потенциальный резервуар для м. abscessus. Действительно м. abscessus устойчив к amoebal фагоцитоза и интра амебы жизни, как представляется, повышение вирулентности м. abscessus в экспериментальной модели инфекции. Однако мало что известно о . м. abscessus вирулентности само по себе. Чтобы расшифровать гены, присвоении преимущество внутриклеточных жизни м. abscessus , была разработана скрининга мутантов библиотеки м. abscessus transposon. Параллельно был разработан метод добычи РНК из внутриклеточные микобактерии после совместного культуры с амебы. Этот метод был проверен и позволило последовательность всего abscessus м. transcriptomes внутри клетки; предоставление, в первый раз, глобальное представление о . м. abscessus адаптации к внутриклеточной жизни. Оба подхода дают нам представление о . м. abscessus Факторы вирулентности, которые позволяют м. abscessus колонизировать airways в людей.

Introduction

Род Mycobacterium включает видов, начиная от безвредные сапрофитных организмов до крупных патогенов человека. Хорошо известные патогенных видов, таких как туберкулез микобактерии, Mycobacterium marinum и микоз здравоохранения принадлежат к подгруппе медленно растущих микобактерий (СГМ). В отличие от подгруппы быстро-растущих микобактерий (АГР) характеризуется их способность образовывать видимые колонии в менее чем за 7 дней на носителе агар. RGM группа состоит из более чем 180 видов, главным образом не патогенные сапрофитные микобактерий. Исследования по АГР взаимодействия с их хозяевами были главным образом сосредоточены на микобактерии smegmatis и продемонстрировать, что эти микобактерий быстро устраняется бактерицидность макрофагов.

Микобактерии abscessus является одним из редких АГР, патогенных для человека и отвечает за широкий спектр инфекций, начиная от инфекции кожи и мягких тканей легких и распространение инфекции. М. abscessus считается, наряду с Mycobacterium avium, главный микобактериальной возбудителя в больных муковисцидозом1.

Различных исследований, выполненных на м. abscessus указывают, что этот микобактерии ведет себя как внутриклеточных патогенов, способные выживать бактерицидной реакция макрофагов и фибробластов в легких и кожи, которая обычно не наблюдается в RGM 2 , 3 , 4. м. abscessus анализ генома определил метаболические пути, обычно встречаются в экологических микроорганизмов при контакте с почвы, растений и водных средах, где бесплатно амёбы зачастую присутствует5. Они также продемонстрировали, что м. abscessus наделен нескольких генов вирулентности, не найден в сапрофитные и непатогенные АГР, вероятно приобретена горизонтальный перенос генов в нише, благоприятные для генетического обмена, который может собрать различные амебы резистентных бактерий.

Экспериментально один из первых поразительных результатов был наблюдения внутриклеточных рост м. abscessus в макрофагах, а что касается микобактерий туберкулеза6. М. abscessus также сопротивляется подкисление фагосомы, апоптоз и autophagy, трех основных механизмов клеточного устойчивость к инфекции2. Даже было показано, что м. abscessus удалось установить непосредственной связи между фагосомы и цитозоле, более питательные среды, которая может пользу бактериальных умножения2. Очень мало известно о геномной преимущества, которые м. abscessus обладает или приобрела возможность выживания в внутриклеточной среды. Амеба coculture является эффективным методом, который позволил изоляции многих новых амебы резистентных бактерий как Mycobacterium massiliense7,8. Способность размножаться в течение амёбы было отмечено, в модели аэрозолизации м. abscessus в мышах, которые могут наделять повышенной вирулентности до4 м. abscessus. Одна из гипотез является, что м. abscessus разработал генетических признаков, возникающих в рамках этой среды, чтобы выжить в фагоцитирующих клеток, которые отличаются от других непатогенных АГР. Эти приобретения может пользу возможность распространения и ее вирулентности в человека-хозяина.

В настоящем докладе описываются инструменты и методы для выделения геномной преимущества, м. abscessus , чтобы выжить в среде амёб, предоставленного. Для этой цели скрининга мутантов transposon м. abscessus впервые описана на штамм Acanthamoeba castellanii типа, которая позволяет идентифицировать мутант дефектных внутриклеточных роста. Также сообщается, второй скрининг в макрофагах, чтобы подтвердить, если этот дефект сохраняется в человека-хозяина. Во-вторых понять, какие механизмы использовались в . м. abscessus адаптироваться к жизни в фагоцитирующих клеток и увеличить свою вирулентность в узле животных, специально адаптированных для м. abscessus метод был разработан, после совместного культуры присутствии амёб, что позволило извлечения всего РНК из интра amoebal бактерий. Как следствие было разработано всеобъемлющее представление о . м. abscessus генов, которые требуются для внутриклеточного жизни.

Protocol

1. Библиотека скрининг Строительство Tn мутант библиотеки Получите transposon библиотеки.Примечание: Для этого эксперимента, мутант библиотека transposon была получена от Эрл Рубин, Гарвардской школы общественного здравоохранения, Бостон, США. Библиотека была построен…

Representative Results

М. abscessus имеет способность противостоять и избежать бактерицидной ответы макрофагов и экологических простейшие как амебы. М. abscessus выражает Факторы вирулентности при выращивании контакте амёб, что делает его более вирулентными на мышах4. Первая ?…

Discussion

Поведение м. abscessus гораздо более похож на поведение патогенных SGM таких микобактерий туберкулеза , чем любой другой микобактерий, принадлежащие РГМ2. Ключевым элементом в патогенности SGM является их способность выжить или даже размножаться внутри антиген представ…

Acknowledgements

Мы признаем значительно Pr. Эрл Рубин (Гарвардской медицинской школы, Бостон, США) за драгоценный подарок мутант библиотека и д-р Бен Маршалл (факультет медицины, Университет Саутгемптона, Великобритания) для исправления рукописи. Мы признаем значительно французской ассоциации пациента муковисцидоз «Вэнкр la Mucoviscidose» и «L’Association Грегори Лемаршалем» для их финансовой поддержки (RF20150501377). Мы также благодарим Национальное агентство для научных исследований (программа DIMIVYR (АНР-13-BSV3-0007-01) НРУ) и округов Иль (Domaine d’Intérêt мажорных Maladies Infectieuses et Emergentes) для финансирования докторантура стипендий V.L-м. Л. л является докторской диссертации от «высшего образования Ministère де et де ла исследований».

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  14. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  15. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  16. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
  17. Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  18. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  19. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  20. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
  21. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
  22. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
  23. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  24. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  25. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  26. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  27. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  28. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  29. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  30. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  31. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  32. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  33. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).

Play Video

Cite This Article
Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

View Video