Summary

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

Published: February 14, 2019
doi:

Summary

Questo lavoro Mostra le potenzialità della tecnologia array (PGA) glycan stampato per l’analisi degli anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali.

Abstract

Il repertorio di anticorpi anti-carboidrati di un dato individuo è spesso associato a sua condizione immunologica. Non solo la condizione immune individuale determina il successo nella lotta contro segnali di minaccia potenziale interne ed esterne, ma anche l’esistenza di un particolare modello di fare circolare gli anticorpi anti-glycan (e la loro variazione di livello sierologica) potrebbe essere un indicatore significativo dell’insorgenza e la progressione di alcune condizioni patologiche. Qui, descriviamo una metodologia basata su stampato Glycan Array PGA che offre l’opportunità di misurare centinaia di obiettivi glycan con sensibilità molto alta; utilizzando una quantità minima di campione, che è un comune restrizione presente quando piccoli animali (ratti, topi, criceto, ecc.) sono utilizzati come modelli per affrontare gli aspetti delle malattie umane. Come un esempio rappresentativo di questo approccio, vi indichiamo i risultati ottenuti dall’analisi del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan nei topi BALB/c. Dimostriamo che ogni topo BALB/c coinvolto nello studio, pur essendo geneticamente identico e tenuta sotto le stesse condizioni, si sviluppa un modello particolare di anticorpi anti-carboidrati naturali. Questo lavoro sostiene di espandere l’uso della tecnologia di PGA per studiare il repertorio (specificità) ed i livelli di anticorpi anti-carboidrati, sia nella salute che durante qualsiasi condizione patologica.

Introduction

Gli anticorpi gioca un ruolo centrale nella nostra difesa contro agenti patogeni d’invasione neutralizzando direttamente virus1,2 e batteri2,3, attivando il complemento system4,5 e il potenziamento della fagocitosi6. Inoltre, essi sono elementi essenziali nel cancro di targeting e l’eliminazione delle cellule maligne7e omeostasi manutenzione8,9.

I disordini del sistema immunitario possono provocare1110 e cancro, malattie autoimmuni ed infiammatorie. Tutte queste condizioni patologiche richiedono idealmente una diagnosi rapida per un trattamento efficace. Nel caso di disordini autoimmuni, sierologica presenza di autoanticorpi nella maggior parte dei casi è un preannunciatore per sistema diagnostico di autoimmunità10,12. Questi anticorpi reagiscono con la superficie cellulare ed extracellulare autoantigeni e, sono spesso presenti per molti anni prima della presentazione di malattia autoimmune10,12. Cancro e deficit immunitari sono anche diagnosticati con esami del sangue che sia misurare il livello di sistema immunitario elementi quali gli anticorpi, o la loro attività funzionale11.

L’identificazione del repertorio di fare circolare gli anticorpi ed i loro livelli sierologici sono di primaria importanza per impostare una prognosi e valutare la progressione di tutte le citate condizioni patologiche. Precedentemente abbiamo dimostrato le potenzialità della tecnica di PGA per l’analisi degli anticorpi in diverse specie animali1316, riducendo al minimo l’uso di grandi volumi di campioni sierologici, evitando il problema associato con gli anticorpi cross-reattività17 e profilatura di alto-rendimento consentendo di un vasto repertorio di anticorpi15.

Basato su glycan immunoassays principalmente sono condizionati, tra altri fattori, l’origine e la produzione di carboidrati, che determinano l’affinità e l’associazione di ligandi15,18,19,20 ,21. Basato su glycan test immunologici possono essere sviluppati in sospensione (microsfere)15,21,22 o in superfici piatto-attivato15,21,22, 23,24. L’ultimo includono ELISA (il più convenzionale di questi metodi) e PGA. Non c’è la quantità di dati confrontando queste metodologie la stessa impostazione sperimentale15,25,26,27. In precedenza abbiamo confrontato l’efficacia e la selettività di questi test immunodiagnostici per gli anticorpi anti-glycan profilo in campioni di plasma umano individuale15. Per alcuni anticorpi come quelli gruppo di sangue anti-A/B targeting, tutti i test immunologici potrebbero individuarli con significatività statistica e hanno correlato positivamente con la vicenda15,18,21. Nel frattempo, gli anticorpi anti-P1 principalmente sono stati rilevati da PGA con il più alto potere discriminante, e non c’era correlazione alle determinazioni fatta da diversi basati su glycan immunoassays15,18, 21. queste differenze tra metodi riguardavano principalmente l’antigene/anticorpo rapporto e glycan orientamento15. Le matrici di ELISA e sospensione sono più suscettibili di associazione aspecifici che PGA perché c’è un eccesso di antigene rispetto gli anticorpi in questi metodi15. Inoltre, l’orientamento dei glicani in PGA è più limitato rispetto a ELISA e sospensione matrici15. ELISA è comoda quando lo Studio include un pannello limitato di glicani. Insieme a matrici di sospensione, ELISA offre più ampia flessibilità per quanto riguarda la riconfigurazione di dosaggio. PGA è eccezionalmente conveniente per scoperta approcci15,18,21,28. Nonostante questi chiari vantaggi e svantaggi, i tre test immunologici accennati potrebbero essere utilizzati per studiare diversi aspetti delle interazioni glycan-anticorpo. L’obiettivo finale dello studio è che quello guiderà la selezione della metodologia più adatta.

Il presente lavoro si propone di estendere l’uso della tecnologia di PGA per l’analisi del repertorio di anticorpi anti-glycan nei piccoli animali. Come un risultato rappresentativo, presentiamo qui un protocollo dettagliato per valutare il repertorio di anticorpi anti-carboidrati naturali in topi BALB/c adulti di PGA.

Protocol

1. Glycochips produzione Preparazione di microarray Stampare i glicani (50 mM) e polisaccaridi (10 µ g/mL) in 300 millimetri di fosfato soluzione salina tamponata (PBS, pH 8.5) alle 6 replica su N-Idrossisuccinimide-derivatizzati vetrini, utilizzo di non-contatto arrayer robotico (drop volume ~ 900 pL). Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sottomatrici (Figura 1A, a colori) ripetuti 6 volte. Ogni singola matrice secondaria è formata da 112 gl…

Representative Results

Qui, presentiamo una sintesi dei risultati rappresentativi ottenuti dalla quantificazione del repertorio di anticorpi naturali anti-glycan in una popolazione di 20 topi BALB/c. Il glycochips utilizzato in questo studio conteneva 419 glycan diverse strutture. Maggior parte dei glicani sono stati sintetizzati come -CH2CH2CH2NH2 distanziatore-armati O-glicosidi, in diversi casi come -CH2CH2NH2 o – NHCOCH<su…

Discussion

Glycan microarrays sono diventati strumenti indispensabili per lo studio di interazioni proteina-glycan40. Il presente lavoro descrive un protocollo basato su tecnologia di PGA per studiare il repertorio della circolazione di anticorpi anti-carboidrati nei topi BALB/c. Dal PGA offre la possibilità ad un gran numero di schermo di glicani biologicamente sconosciuto, è una scoperta eccezionalmente conveniente strumento13,15,<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) concedere PI13/01098 da Carlos III Health Institute, Ministero della salute spagnolo. DB-G è stato beneficiato da una posizione di post-dottorato di ricerca finanziata dal Unione europea settimo programma quadro (FP7/2007-2013) sotto il 603049 di accordo Grant (TRANSLINK). Lavoro di NK, NS e NB è stato supportato da grant #14-50-00131 di russo Science Foundation. DB-G vuole esprimere la sua gratitudine a Marta Broto, J. Pablo Salvador e Ana Sanchis per l’eccellente assistenza tecnica e Alexander Rakitko per assistenza nell’analisi statistica. Con il supporto della “Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats ho Recerca del Departament aziendali ho Coneixement Gestio Guida de la Generalitat de Catalunya (grant numero 2018 DI 021). Ringraziamo CERCA programma / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale.

Materials

Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

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