Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.
Die Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit (AD) zeichnet sich durch die Anhäufung und Aggregation von Amyloid-β (Aβ) Peptide in extrazelluläre Plaques des Gehirns. Die Aβ-Peptide, bestehend aus 40 Aminosäuren entstehen aus Amyloid-Precursor-Protein (APP) von β und γ-Secretases. Aβ lagert sich nicht nur im zerebralen Parenchym, sondern auch in Leptomeningeal und zerebralen Gefäßwänden, bekannt als zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Während eine Vielzahl von Aβ-Peptide wurden identifiziert, die Produktionsfeinplanung und Verteilung der einzelnen Aβ-Peptide in pathologischen Geweben von AD und CAA nicht vollständig beantwortet. Hier entwickeln wir ein Protokoll des Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) auf menschlichen Autopsie Hirngewebe, umfassende Protein Zuordnung zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden menschliche kortikalen Exemplare von Brain Bank am Tokyo Metropolitan Institut für Gerontologie erhalten. Gefrorene Cryosections werden geschnitten und an Indium-Zinn-Oxid (ITO)-Glas-Objektträger beschichtet. Spektren werden erworben durch die MALDI-System mit einer räumlichen Auflösung bis zu 20 µm. Sinapinic Säure (SA) ist gleichmäßig auf der Folie verwenden entweder eine automatische oder eine manuelle Spritze hinterlegt. Mit den aktuellen technischen Vorteilen der MALDI-IMS erhalten Sie ein typischen Datensatz von Aβ-Gattungen innerhalb der gleichen Abschnitte des menschlichen autopsied Gehirne ohne spezifische Sonden. Darüber hinaus mit hoher Auflösung (20 µm) Bildgebung eines AD Gehirn und schweren CAA-Beispiel zeigt deutlich, dass Aβ1-36 Aβ1-41 in Leptomeningeal Gefäße, abgelagert wurden, während Aβ1-42 und Aβ1-43 in zerebralen Parenchym als senile Plaques (SP) abgelagert wurden. Es ist möglich, MALDI-IMS als einen Standardansatz in Kombination mit klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen im Verständnis der Pathologie des AD, CAA, anzunehmen und anderen neurologischen Erkrankungen auf Basis der aktuellen Strategie.
Um die Diagnose zu stellen und der Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen zu verstehen, ist genaue molekulare Identifizierung der pathologischen Ablagerungen wichtig1. Im Zuge der AD, Aβ produziert, um SPs in der zerebralen Parenchym zu machen und in Gefäßen abgelagert lange vor Krankheit Beginn2,3,4,5,6. Aβ1-42 ist das vorherrschende Peptid in der SP AD Gehirne, andere Aβ-Varianten, z. B. N-terminale oder C-terminale abgeschnitten oder Aβs geändert, auch in betroffenen AD Gehirne7,8,9identifiziert werden, 10. Ein vollständiges Bild von der breiten Palette von Aβ-Arten im menschlichen Gehirn, vor allem mit AD und zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA)11, hilft Wissenschaftlern Aβ-Produktion, Stoffwechsel und Ablagerung zu verstehen.
Als der klassische Ansatz der Neuropathologie wurde Immunhistochemie (IHC) die schlüssigste Methode zur Bestimmung der Lage des Aβs im Gehirn Gewebe12,13,14,15. Im Allgemeinen kann IHC Moleküle nicht unterscheiden, wenn mehrere Epitope gleichzeitig koexistieren. Im Gegensatz dazu ist eine aufstrebende Massenspektrometrie-basierte Proteomic Analyse einen wertvollen Ansatz vor allem für die Analyse von einer Vielzahl von Aβ-Arten im Hirngewebe, die mit Antikörpern16,17unterscheiden lassen. Die konventionellen Massenspektrometrie-basierte Analyse von Gehirn Lysates und Immuno-ausgefällt Proben nicht kleinere Aβ-Peptide erkennen und verliert Verteilungsinformationen von Aβ im Hirngewebe.
In früheren Arbeiten war Visualisierung von Aβ-Ablagerungen im Gehirn der Maus mit einem transgenen Tiermodell von AD, z. B. APP23 erfolgreich. Dieser Prozess benötigt allerdings noch technische Weiterentwicklungen, IMS und IHC in Bezug auf Auflösung und Empfindlichkeit18,19,20zu vergleichen. AD Neuropathologie auf menschliche Gehirne untersucht werden, und wir auf menschlichen Autopsie Hirngewebe MALDI-IMS-Technologie verwendet, um umfassende Protein Mapping21zu erhalten. Zu diesem Zweck entwickelten wir ein Protokoll für eine erweiterte Art der Massenspektrometrie, das Vorteile in seiner Schnelligkeit, Sensitivität und Reproduzierbarkeit.
Hier zeigten wir ein detailliertes Protokoll und Ergebnisse der Visualisierung von Aβ und seine Isoformen aus mehreren autopsied Gehirne mit AD und CAA mit MALDI-IMS. Die Ablagerung Profil des Aβs änderte drastisch aus Aβ1-42 in N und C-terminalen Variationen. Aβ1-41 wurde zum ersten Mal identifiziert und im menschlichen Gehirn mit dem aktuellen Protokoll visualisiert und mit IHC21weiter validiert wurde. Wenn man bedenkt, dass die Morphologie der hinterlegten Aβ von IMS mit einer hochauflösenden Analyse (20 μm) muss in guter Übereinstimmung mit IHC, tragen IMS und IHC gleichermaßen zur Unterscheidung von Aβ-Einlagen durch ihre Lage und Proteingehalt sowie durch ihre Morphologie. Da das gesamte Experiment hier beschriebenen im okzipitalen Kortex durchgeführt wurde, wird die Lokalisierung von Beta-Amyloid-Arten in allen Gehirnregionen zu studieren mit weiteren Untersuchungen über das aktuelle Protokoll verallgemeinert werden.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind Gewebe Vorbereitungsschritte, eine effektive Ionisierung der aggregierten Proteinen im menschlichen Gehirn Gewebe zu erhalten. Eine Matrixschicht ist erforderlich, um die Laserenergie absorbieren und Desorption und Ionisation des Analyten zu induzieren. In diesem Prozess wird ein gesamte Gewebe Abschnitt homogen mit kleinen Kristallen beschichtet. Homogene Cocrystallization des Analyten mit der Matrix ist entscheidend für hohe Empfindlichkeit und artefaktfrei Imaging. Jede der drei Spray Methoden hat seine eigenen Vorteile. Manuelle Spritzen gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden. Ein Airbrush ist praktisch; Es erfordert jedoch geschickte Bedienung. Präzise und reproduzierbare experimentelle Technik unverzichtbar ist, wird mit einem Ultraschall Sprüher und/oder eine automatische Spritze wie beschrieben in die aktuellen Protokolle empfohlen. In Bezug auf ein Ultraschall Sprüher wird es nicht durch die Feuchtigkeit und die Temperatur des Raumes beeinflusst werden, weil es in eine Kammer gesprüht wird. Unterdessen wird durch eine automatische Spritze relativ erhaltener räumlicher Auflösung mit guter Reproduzierbarkeit erreicht. In der Regel die räumliche Auflösung erreicht mit der Erhöhung der drei Methoden in der Reihenfolge der Airbrush (1), (2) automatische Geräte- und (3) Ultraschall Sprüher.
Am wichtigsten ist, wurde dieses Protokoll ursprünglich generiert, um zu erkennen und Aβs im menschlichen Gehirn Autopsie Proben zu visualisieren. Die Visualisierung von Aβs mit MALDI-IMS für APP23 Mäuse, die als Tiermodell Werbeanzeige auf der Grundlage der Schwedisch-Art Mutation des menschlichen APP erzeugt wird, wurde früher von anderen mit einer bestehenden Methode18,19berichtet. Das ehemalige Protokoll angewendet APP23 reichte jedoch nicht, Aβ in seine laterale Auflösung und Empfindlichkeit zu visualisieren. Frühere Arbeiten besprochen, daß hohe Aβ-Konzentrationen außerhalb der Begrenzungen des Gewebes sind eindeutig Artefakte im APP23 Bildgebung mit ihrem Protokoll18,19. Das bedeutet, dass die so genannte “zwischen realen SPs und IMS Bilder aufgrund der Matrix Extraktionsschritt Unschärfe” mit MALDI-Typ Bildgebung unvermeidlich war. Jedoch in das aktuelle Protokoll die Unschärfe verschwand und jedes Spektrum vertreten alle Einzel-SP in der Anwesenheit von.
Wie hier gezeigt, wir können Aβ1-41 n. Chr. erstmals verfolgen und CAA Gehirne mit MALDI-IMS sowie mit IHC, mit einem spezifischen Antikörper durch unsere eigene Generation21. Nach der Aβ-Verarbeitungsmodell leitet sich Aβ1-38 von der Aβ1-45 über Aβ1-42, während Aβ1-45 von γ-Sekretase schrittweise Spaltung27,28,29,30,31 Aβ1-41 abgeleitet . Dies bedeutet, dass das aktuelle Protokoll dieses Modell unterstützt. Für die Grenzen dieser Technik müssen wir die Heterogenität der Proben aus menschlichen Autopsie Gehirn betrachten. Der wichtigste Schritt, in gewisser Weise ist qualifizierte Autopsie Hirngewebe mit ethischen Beweis zu beurteilen. Mit dem aktuellen Protokoll über diese qualifizierten Autopsie Hirngewebe können MALDI-IMS individuell verfolgen den gesamten Vertrieb komplexer Moleküle, nachdem mehrere Modifikationen sowie unbekannte zur Regulierung der Pathogenese der AD, die noch zu definiert. Darüber hinaus muss die allgemeine Pathogenese der verschiedenen Neuropathologie in Alter menschliche Gehirne zu verstehen, es MALDI-IMS als einen Standardansatz in Kombination mit klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen bei neurologischen Erkrankungen übernehmen durchführbar .
Ein weiterer entscheidender Schritt der MALDI-IMS ist Data-Mining-Prozess aus dem gewonnenen Datensatz, welcher immer zeitaufwändig. Manuelle Data-Mining für jede Distribution Peak muss die Benutzer klicken sich durch jedes Bild und suchen Sie nach Distributionen, die auf die Morphologie der analysierten Probe korrelieren können. Automatische räumliche Segmentierung kann als erster Schritt der Daten Bergbau, bietet eine Übersicht der eingestellten Daten und ermöglicht die schnelle Erkennung von herausragenden Merkmale verwendet werden. Bei diesem Ansatz Ähnlichkeiten zwischen Spektren einer bestimmten Region werden statistisch bestimmt und ähnliche Spektren in einem Cluster gruppiert sind. Alle Pixel sind farblich gekennzeichnet, entsprechend ihrer Cluster-Zuordnung (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie AD/CAA ist der Bereich von Interesse der Raum der Aβ-Ablagerungen in parenchymatösen Plaque und den Subarachnoidalraum und parenchymatösen vaskulären Strukturen. Die zwei markanten Gipfel mit IHC weiter validiert wurden waren die m/Z-Werte von Aβ1 40 und Aβ1-4221. So ist es einfach, colocalized m/Z mit Aβ1 40 und Aβ1-42, die bereits kommentierte, N und C-terminalen abgeschnittene Aβ sowie unbekannte Peptide zur weiteren Analyse zu finden.
Weller und Kollegen haben berichtet, dass Aβ in Gefäßwänden, mehr um Arterien als um21Adern ansammelt. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die interstitielle Flüssigkeit (ISF) Aβs enthält, die Lymphknoten über eine perivaskuläre Entwässerung Weg22,23,24,25 aus der zerebralen Parenchym ausgeschieden ,26. Das aktuelle Protokoll eine Segmentierung Karte basierend auf einem MALDI-IMS-Daten-Satz mit einer 20 µm Auflösung generieren unterstützt die mögliche Existenz von perivaskuläre Entwässerung Wege des Gehirns (Abbildung 5), die wesentlich, CAA in AD21 beitragen , 32. Darüber hinaus können wir entdecken, Markerproteine colocalized mit Plakette und subarachnoidale Gefäßsystem durch die Berechnung der Korrelation von jedem m/Z-Werten. Es muss für das Verständnis der allgemeine Pathogenese der verschiedenen Neuropathologie in Alter menschliche Gehirne, machbar, MALDI-IMS als ein leistungsfähiger Ansatz in Kombination mit etablierten IHC Daten von klinischen, genetischen und pathologische Beobachtungen bei neurologischen anzunehmen Krankheiten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen unterstützt (Gehirn Protein Altern und Demenz Kontrolle 26117004; M.I und th.M.). Diese Forschung wurde teilweise durch die strategische Forschungsprogramm Brain Sciences von der Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) unterstützt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien ankommen.
Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
Scanner | EPSON | GT-980 | |
Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |