ونحن تصف كيفية تمكين التقنيات المتناهية الصغر و photomanipulation مثل فراب وفوتواكتيفيشن تحديد بارامترات حركية وديناميات الزمانية المكانية للبروتينات داخل ترحيل الخلايا. قراءات تجريبية تشمل ديناميات سوبسيلولار ودوران المنظمين حركية أو cytoskeleton أكتين الكامنة.
يمكن أن تكشف دراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات أهميتها الوظيفية في سياقات مختلفة. في هذه المقالة، أنها ناقشت الانتعاش الفلورسنت كيف بعد فوتوبليتشينج (فراب)، وتقنيات فوتواكتيفيشن يمكن استخدامها لدراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات في مواقع سوبسيلولار. نعرض أيضا كيفية تمكين هذه التقنيات مباشرة تحديد معلمات مختلفة مرتبطة بحركية التنظيم وخلية cytoskeletal أكتين. وعلاوة على ذلك، microinjection الخلايا هو بالإضافة إلى ذلك وصف كعلاج بديل (يحتمل أن تكون السابقة أو مكملة لتقنيات photomanipulation السالفة الذكر) الآثار الزناد لحظية لذوبانها البروتينات في الخلية مورفولوجيا والدالة. ميكرومانيبوليشن مثل حقن بروتين أو التطبيق المحلي للمخدرات نفاذية غشاء البلازما أو مثبطات سيتوسكيليتال يمكن أن تخدم كأداة قوية لتسجيل النتائج الفورية لعلاج معين على سلوك الخلايا في خلية واحدة وسوبسيلولار المستوى. وهذا يتمثل هنا الفوري التعريفي لبروز حافة الخلية لاميليبوديال بحقن المؤتلف Rac1 البروتين، كما أنشئت منذ ربع قرن. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم على بروتوكول لتحديد معدل دوران للبروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-بسب، بوليميراز خيوط أكتين تراكم مكاناً بارزا في نصائح لاميليبوديال الخلايا B16-F1، وتوظيف فراب ومنها المرتبطة البيانات تحليل وتركيب المنحنى. ونقدم أيضا مبادئ توجيهية لتقدير معدلات لاميليبوديال أكتين شبكة البلمرة، المتمثلة في الخلايا معربا عن معلم اجفب β-أكتين. وأخيراً، هناك تعليمات لكيفية التحقيق في معدلات أكتين مونومر التنقل داخل السيتوبلازم الخلية، متبوعاً بإدماج أكتين في مواقع الجمعية خيوط السريع، مثل النصائح من جاحظ لاميليبوديا، باستخدام فوتواكتيفيشن النهج. أي من هذه البروتوكولات مقيد إلى مكونات أو المنظمين من cytoskeleton أكتين، ولكن يمكن أن تمتد بسهولة إلى استكشاف في أزياء مماثلة ديناميات الزمانية المكانية ووظيفة البروتينات في مختلف هياكل سوبسيلولار مختلفة أو الوظيفية سياقات.
رصد ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات والجزيئات الأخرى في الخلايا الحية قد أصبحت أداة أساسية في مجالات عديدة من الخلية والبيولوجيا الجزيئية. تقنيات الفحص المجهري بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق) وعمر الحنق-الأسفار التصوير (الحنق-فليم) متقدمة الأسفار، أو السماح فراب وفقدان fluorescence في فوتوبليتشينج (الوجه) وفوتواكتيفيشن، فضلا عن العديد من الآخرين الزماني والمكاني تتبع لتفاعلات البروتين البروتين، التغييرات كونفورماشونال، فضلا عن تحديد الحركية نشر وتعريب مختلف البروتينات في الخلية1،2. تقنيات فراب وفوتواكتيفيشن، على وجه الخصوص، قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة المنظمين للهجرة سيتوسكيليتون وخلية أكتين. هذه التقنيات يمكن تطبيقها منفردة أو مجتمعة مع تقنيات ميكرومانيبوليشن إضافية مثل microinjection3، وتنطوي على التعبير عن البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. أنها تسمح تقدير حركية رابطة البروتين الغنية أكتين الهياكل المعنية بالهجرة الخلية، مثل فيلوبوديا أو لاميليبوديا، دوران البروتينات في الالتصاقات البؤري4، أو تشعبت أكتين الشبكات5. وهي تمكن أيضا تحديد معدلات بلمرة الأكتين لاميليبوديال، تقييم تشتت أكتين أحادي داخل سيتوسول، معدل أكتين سوبسيلولار مونومر إزفاء إلى مبلمرة خيوط الأكتين في جاحظ لاميليبوديا6، وغيرها من المعالم.
فراب طريقة لتصور والتحديد الكمي لتنقل البروتينات داخل خلية حية، وضعت أصلاً في السبعينات اكسلرود7. منطقة الاهتمام (ROI) داخل خلية، يسكنها مع البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، يتعرض عابر لليزر عالية الكثافة، كافية لتسبب تبيض من جزيئات فلوروفوري الموجودين في هذه المنطقة خلال فترة زمنية قصيرة معينة. غير مقصور، المسمى فلوريسسينتلي البروتينات الموجودة خارج العائد على الاستثمار خلال التبييض، سوف منتشر واختراق منطقة المبيضة اعتماداً على ديناميتها الزمانية المكانية، مما تسبب في تشريد الجزيئات فوتوبليتشيد على مر الزمن. معدل الاسترداد fluorescence في المناطق المبيضة تعتمد على عوامل مختلفة، بما في ذلك الحجم ومعدل انتشار جزيء معين، وطبعا المرتبطة معدل الدوران داخل المفترضة هيكل المبيض. وهكذا، سوف التوسط من أجل انتعاش الأسفار داخل دوروا المبيضة سريعاً من خلال نشرها، بينما البروتينات محكم المرتبطة بالهياكل مثل الالتصاقات التنسيق البروتينات القابلة للذوبان، سوف يكون وقت أطول للدوران، كما سيتم استردادها الأسفار تعتمد على نشر جزء صغير قابل للذوبان من حركية البروتين وتفكك رابطة الكسر المرتبطة بهيكل. عادة ما يكتسب الانتعاش الأسفار وكمياً حتى يتم التوصل إلى المستوى الأولى لكثافة ما قبل التبييض للأسفار. ومع ذلك، لا يحدث هذا إذا كان جزء من شدة الأسفار الأولى ينتمي إلى ما يسمى الكسر غير متحركة، وغير قادر على أن تتجدد بنشرها أو يتم تغذيته بمعدلات بطيئة جداً بالمقارنة مع معظم الجزيئات تتألف من الهاتف النقال كسر. لتحديد معدل دوران البروتين، يتم إنشاؤها المنحنيات فراب، تمثل مدى الانتعاش الأسفار على مر الزمن. من هذه المنحنيات الانتعاش، يمكن حساب نصف متوسط من البروتين الانتعاش. عن طريق إنشاء منحنى يناسب متوسط فراب البيانات والتحليلات الرياضية ومن ثم، من الممكن أيضا للاستدلال على ما إذا كان معدل دوران متوسط الكسر المحمول يشكل مركب سكان متجانسة واحدة من الجزيئات، أو ما إذا كان وهو يتألف من الفئات السكانية الفرعية اثنين أو أكثر من الجزيئات تقليب أسعار تفاضلية. بالإضافة إلى تقدير معدلات دوران البروتين بالنهج الكمي، تتبع انتعاش المناطق فوتوبليتشيد في لاميليبوديا يمكن أن تسمح أيضا لدقة التحديد الكمي لمعلمات حركية لاميليبوديال مثل تدفق إلى الوراء، وبروز، ومعدلات بلمرة الأكتين. وهكذا، يشكل فراب أداة متعددة الاستخدامات التي ينبغي تطبيقها لتقييم المعلمات المختلفة داخل هياكل الخلايا الحية.
فوتواكتيفيشن أسلوب يستخدم لتعقب نشر والتنقل من البروتينات أو جزيئات مصدرها موقع خلوي معين. التقنية تستخدم، على سبيل المثال، متغير بروتين البرية من نوع فلورسنت الأخضر (التجارة والنقل)، وضعت في البداية باترسون ويبينكوت شوارتز8، والذي هو تحور بطريقة تسمح الأسفار الغاية تزداد عند التعرض الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (حوالي 400 نانومتر؛ وهنا، 405 nm). كما وصفها باترسون et al.، صباغات التجارة والنقل البرية من نوع الوجود كعدد سكان مختلطة الفينولات محايدة وانيوني فينولاتيس، التي تنتج ذروة امتصاص رئيسية في حوالي 397 نانومتر وواحدة ثانوية في 475 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. عند تشعيع البروتين مع الأشعة فوق البنفسجية، يخضع السكان فوتوكونفيرسيون، التحول نحو النموذج أنيونى. عندما ولع 488 نانومتر، يسلك البروتين فوتوكونفيرتيد/فوتواكتيفاتيد بزيادة 3-fold في الأسفار، غير كافية في ممارسة للتمييز بين المنشط وغير-تنشيط التجارة والنقل بسبب الأسفار الخلفية الجوهرية عالية. ومع ذلك، تحقق انخفاض في كثافة الخلفية بإدخال طفرة واحدة من الأحماض الأمينية ضمن تسلسل التجارة والنقل (استبدال الحامض الأميني في موقف 203). متحولة T203H الناجمة عن ذلك، المعروفة أيضا باسم فوتواكتيفاتابل-التجارة والنقل (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) ويتسم بانخفاض كبير في امتصاص ذروة البسيطة، التي تزداد تقريبا معززات عندما متحمس في وقت لاحق من 488 نانومتر الضوء عند التشعيع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومن ثم، overexpression بروتينات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم هو نهج مستخدمة على نطاق واسع، مما يسمح بتحديد نشر وحركية الجزيئات داخل الخلايا. قد طبقنا سابقا أكتين السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم لتحديد معدل تشتت مونومرات أكتين بعيداً عن مناطق سيتوسوليك، السماح بالتنقيب ليس فقط من حركتها داخل في سيتوسول، ولكن أيضا معدل التأسيس إلى بروز شبكة أكتين لاميليبوديال6. كما يصف الأدب أكثر حداثة الرواية، وصور قابلة للتحويل من البروتينات التي يمكن من حيث المبدأ بطريقة مماثلة، ولكن إيواء ميزة يحتمل أن تكون مرئية مسبقاً قبل تحويل الصور. وتشمل أمثلة لهذه المجموعة من البروتينات الفلورية Dendra2 و mEos29،10،،من1112.
في هذه المقالة، نحن شرح منهجية الخلايا ميكروينجيكتينج مع البروتينات. كذلك نشرح كيف يمكن دمج هذه التقنية مع فراب، بالبروتينات فوتوبليتشينج المشاركة في التنظيم cytoskeleton أكتين وحركية، وكيف يمكن اشتقاق منحنيات فراب ونصف الوقت لتعافي كسور المتنقلة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مثالاً على كيف يمكن استخدام الأسلوب فراب لتحديد معدلات بلمرة الأكتين لشبكات لاميليبوديال. كما أننا نقدم توجيهات ونصائح بشأن كيفية إجراء التجارب فوتواكتيفيشن، والتي يمكن استخدامها لتحديد معدلات لإدماج أكتين لاميليبوديا والتنقل سيتوسوليك من أكتين أحادي. هذه التقنيات، بالطبع، ليست فقط محدودة لتتبع مكونات cytoskeleton أكتين، ولكن يحتمل أن تكون مطلوبة وتكييف معتدلة أو التحسين، يمكن تطبيقها على نطاق واسع لأنواع الخلايا الأخرى أو للتحقيق في البروتينات المختلفة، والهياكل، و معلمات.
هنا نناقش الخطوات الحاسمة في التقنيات الموضحة في هذه المقالة، وكيف يمكن أن يكون الأمثل للتطبيق في ظروف تجريبية مختلفة.
Microinjection هو طريقة التي يمكن تطبيقها على رصد الآثار الفورية من إدخال البروتينات الخارجية أو مثبطات أو المخدرات في الخلايا. يمكن أن تكون مفيدة خاصة لتحديد وظائف البروتينات في صعوبة ترانسفيكت أنواع الخلايا أو في حالات عندما ليس هو المطلوب التعبير الطويل الأجل. تجدر الإشارة إلى أن بقاء أنواع معينة من الخلايا يختلف اعتماداً على أنها هي تبذر في المصفوفة خارج الخلية. آخر بطانية أو الظهارية أو تنتجها الخلايا الليفية مثل أنواع الخلايا، حتى الصغيرة منها مثل السمك كيراتوسيتيس (انظر دانغ et al. يمكن حقن 21 وأندرسون و عبر22) بنجاح. ومع ذلك، هناك استثناءات، مثل الخلايا B16-F1 المصنف في لامينين، التي تشكل نظاما نموذجا ممتازا للهجرة الخلية، ولكن غير متوافقة مع حقن على هذا النوع من التحتية لسبب غير معروف. للخلايا NIH3T3 تنتجها الخلايا الليفية، ونقوم بشكل روتيني حقن فيبرونيكتين التحتية، وتقنيات photomanipulation إضافية مثل اربط (حتى مع فوتواكتيفيشن؛ وهو مبين للخلايا B16-F1 هنا) يمكن أن يتم أيضا في هذه الخلايا الليفية (انظر على سبيل المثال، Köstler et al. 3)-فإنه يجب النظر أيضا في أن البروتينات المختلفة، وفقا لخصائصها الوظيفية وأهداف التجربة، قد يستغرق كميات مختلفة من الوقت لتتسبب في تغييرات، تتراوح بين ثوان إلى ساعات. ميزة هذا الأسلوب هو أن الجرعة/تركيز وكيل خارجية يمكن التحكم بأدق على مستوى الخلية الواحدة من مثلاً، عند استخدام تعداء بلازميد. وبالإضافة إلى ذلك، علامات مضيئة للبروتين لا ضرورة لضمان وجودها في الخلية، والتي يمكن أن تزيد من المرونة إذا كان مطلوباً المتزامنة التصور متعدد القنوات الأخرى البروتينات معلم فلوريسسينتلي. Microinjection يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لتحليل الآثار الفورية لبروتينات محددة أو مخاليط البروتين على التغيرات الدينامية مورفولوجيا الخلايا أو سيتوسكيليتون (مثلاً، دانغ et al. 21 على سبيل مثال من آثار فورية على الهجرة المانع المعقدة Arp2/3 أربين). عيب هذا الأسلوب هو في اختزاع، الذي يمكن أن يسبب تلف الخلايا أو التأثير على مورفولوجيا الخلايا. ولذلك، هو رصد أحد الاعتبارات هامة عند أداء ميكروينجيكشنز بقاء الخلية. يعتمد الأسلوب الذي قدم هنا على التلاعب اليدوي. في شروط اختبارها لتكون متوافقة مع حقن الناجحة، مثل الخلايا الليفية التي تنمو على فيبرونيكتين التحتية، يسمح بروتوكول الحقن اليدوي الموضحة هنا بمعدل نجاح 100 ٪ قريب؛ وهذا ضروري عند الجمع بين هذا النهج مع تجارب متابعة معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً، بما في ذلك الفحص المجهري الفيديو أو فراب، كما نشرت سابقا3. وهذا لا يستبعد أن أحياناً، وخلايا فردية قد يعانون من حدث microinjection، الذي يمكن التعرف عليه بأمان بالتغيرات المفاجئة لتباين كل من النواة والسيتوبلازم، متبوعاً بسحب حافة الخلية. استبعاد هذه الحالات التجريبية نادرة وبالتالي عدم النظر في مزيد من التحليلات.
بيد نهجاً نصف أوتوماتيكية أيضا يستخدم عادة، على سبيل المثال استخدام السريع (< 300 مللي) إبرة تسيطر آلة تخفيض تزامنت مع زيادة ضغط الحقن، حيث أن الإبرة فقط يجب أن توضع فوق كل خلية قبل كل منهما حقن. معدل نجاح حقن نصف أوتوماتيكية بتعريف أقل من دليل النهج المبين أعلاه، ببساطة لأنه الأمثل للسرعة، متبوعاً بتحليل العديد من الخلايا التي نجت بنجاح هذا العلاج؛ وهكذا فإنه لا تعتمد على حقن ناجحة من خلية مفردة. ولذلك، بدلاً من تحليل خلية مفردة، حقن نصف أوتوماتيكية أكثر ملاءمة لتحليل آثار حقن الخلايا مئات عدة، مثلاً، بالفيديو المجهري تكبير منخفضة أو عند تثبيت الخلية وتلطيخ. بغض النظر عن المتبع مفصلة، microinjection لا يشكل مقايسة نقطة نهاية، ولكن يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك فراب أو فوتواكتيفيشن3.
وعند تحديد معدل دوران البروتين من فراب، كثافة الليزر يجب أن يكون الأمثل، تبعاً لظروف الإعداد والتصوير بالمجهر (التكبير، الأهداف، إلخ، فضلا عن نوع الخلية والهيكل، والبروتينات الفلورية ل فوتوبليتشينج). لاحظ أن في طاقة الليزر الأمثل، تبيض فعالة هو جنبا إلى جنب مع د أقل قدر ممكن، لتجنب الانكماش أو إكمال سحب هيكل إطار التحليل (مثلاً، لاميليبوديا أو فيلوبوديا) أو الضرر حتى على المستوى الخلوي. ومن الناحية المثالية، ينبغي تحقيق 70 – 80 في المائة على الأقل من ابيضاض الكفاءة، على الرغم من أن التبييض كاملة قد تعوقها عن الدوران السريع للغاية من البروتين، في هذه الحالة، أي شيء أكثر من 50 في المائة قد أيضا يكون مقبولاً. ينبغي اختبار قوة تبيض الأمثل لهيكل معين وصبغة الفلورسنت تجريبيا، بدءاً بليزر منخفض طاقة متبوعاً زيادة تدريجية. وبطبيعة الحال، أي صبغة الفلورسنت يمكن بتعريف يكون مقصور بالليزر الخفيفة القريبة من ذروته الإثارة (488 نانومتر للأصباغ الخضراء المستخدمة بشكل متكرر مثل فيتك أو اجفب). ومع ذلك، أشعة الليزر مع أطوال موجية أقصر، مثل أشعة الليزر، والقرب من الأشعة فوق البنفسجية تسليم سلطات أعلى وبالتالي يمكن أن تستخدم أيضا للتبييض الفعال من الأصباغ المستخدمة عادة. أننا نستخدم بشكل روتيني 405 نانومتر ليزر صمام ثنائي (120 ميجاوات) للتبييض اجفب وصبغات الفلورسنت الأحمر (مثل مشري)، أن كان ذلك بكفاءة أقل بشكل طفيف في حالة الأخير (البيانات لا تظهر). كما يمكن أيضا استخدام nm 405-صمام ثنائي فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل (انظر أدناه)، فإنه يمنح هذا النظام بالمرونة القصوى.
وطبقت للهياكل الخلية B16-F1 والبروتينات الفلورية فوتوبليتشيد هنا، 405 نانومتر الليزر القوى بين 65 – 100 ميغاواط. عند تحليل منطقة فوتوبليتشيد، من المهم أن تنظر في ما إذا كان هيكل معين يتم الاحتفاظ في شكله الأصلي على التحليل الفترة الزمنية. على سبيل المثال، عند تحليل دوران بروتينات في نصائح لاميليبوديا، ينبغي الحرص ما إذا كان يتم تعديل انحناء لاميليبوديا بشكل ملحوظ على مر الزمن، كالتغيرات في انحناء قد تؤدي إلى نتائج غير دقيقة إذا حلل المنطقة/الكفاف لا كامل يشمل الهيكل في كل إطار المقاسة بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الحزم المضمنة في لاميليبوديا، مثل ميكروسبيكيس، قد تسبب الانحرافات في كثافة الأسفار. كما هو موضح في الشكل 2ب (السهم الأبيض في الإطار الزمني s 9)، بنية ميكروسبيكي تشبه يقع بجوار منطقة فوتوبليتشيد المقاسة، ولكن يبقى خارجها طوال فترة القياس، ومما لا يسبب أي عدم دقتها. لمزيد من التحليل لدوران البروتين، اعتبارات هامة عند اختيار الموقع والحجم لتحليل المناطق أن الأسفار مرور الوقت يجب لا إلى حد كبير يتأثر بالتغييرات في مورفولوجيا الخلايا أو عوامل أخرى من جد لتجنب اقتناء فوتوبليتشينج. على سبيل المثال، هياكل تقديم مساهمة كمية كبيرة في هيكل تحليل ينبغي أن لم نقل خارج المنطقة المقاسة أثناء التحليل؛ وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن لا أدخل الكيانات غير ذات صلة، ونيون مثل هياكل حويصلية التي تجتذب البروتين مجال الاهتمام أثناء التحليل. لتحديد معدل بلمرة الأكتين لاميليبوديال، ينبغي الحرص أن يتم تحليل لا التراجع أو الإزعاج (أي، صعودا للطي) لاميليبوديا، كما أن هذا سوف تؤثر بقوة على دقة النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، قد تظهر تراجع مناطق لاميليبوديال إزفاء الخلفي السريع، يمكن أن يفضي إلى المبالغة في تقدير معدلات بلمرة الأكتين لاميليبوديال. وهناك اعتبار آخر هو مسافة مناطق التطبيع داخل الخلايا (التي اتخذت كمواقع مرجعية لتصحيح فوتوبليتشينج اقتناء) من الوضع الفعلي فوتوبليتشينج، التي ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لتجنب المباشرة التأثير بمنطقة فوتوبليتشيد.
عند إعداد الشروط المثلى فوتواكتيفيشن من بنيات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم، ينبغي الحرص على تجنب تبيض فورية أثناء فوتواكتيفيشن. في عملنا، وتم الحصول على أفضل النتائج مع سلطات ليزر أقل من 5-10 مرات من العاملين لحسابهم عادة للتبييض من اجفب. للحصول على الصور من جزيئات فوتواكتيفاتيد، زمن التعرض للضوء والفاصل الزمني بين الإطارات ينبغي الأمثل بالنظر إلى حجم المناطق والهياكل لتكون فوتواكتيفاتيد وتحليلها، فضلا عن إمكانية تنقل فوتواكتيفاتيد البروتينات إلى مواقع أخرى سوبسيلولار. أما بالنسبة لجميع أنواع التصوير الأسفار، الحفاظ على بقاء الخلية أمرا حاسما للحصول على النتائج ذات الصلة فسيولوجيا.
من حيث المبدأ، يشكل فوتوكونفيرسيون الأخضر إلى الأحمر من البروتينات الفلورية مثل ميوس أو درونبا المتغيرات12 طريقة قوية على قدم المساواة لديناميات التالية ودوران الهياكل سوبسيلولار مثل لاميليبوديوم (انظر على سبيل المثال، برنت et al. 23)-الاستفادة من الأسلوب الأخير بدلاً من السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل ستكون إمكانية متابعة الديناميات البروتين قبل وبعد التحويل مع اثنين من الألوان المميزة، دون الحاجة للتعبير عن المشاركة بروتين فلورسنت أحمر إضافية. بيد في تجاربنا الأولية، مدى تغيير التباين وشدة الفلورسنت إشارة تحقيقه عند فوتواكتيفيشن للسلطة الفلسطينية-التجارة والنقل أكبر مقارنة بالمسابير فوتوكونفيرتيد، ربما كان بسبب السمات الطيفية متفوقة الأخضر مقابل الأحمر الفلورسنت المسابر (البيانات لا تظهر). على أي حال، دراسات مفصلة عن دوران خيوط الأكتين في نتوءات الحافة الخلية مثل لاميليبوديا أو ذيول أكتين الناجمة عن فيروس اللقاحية حتى الآن فقط تم نشر استخدام السلطة الفلسطينية-بروتينات فلورية خضراء مشتقات5،،من624.
عند النظر في أي منطقة الخلية لتحليل أثر فوتواكتيفيشن، عدة عوامل يجب أن تؤخذ في الاعتبار، التي تناقش باستخدام مثال محدد هو موضح هنا (دمج مونومرات أكتين على حافة الخلية عند التنشيط في سيتوسول)، ولكن ويمكن استقراء التأكيد لمختلف المشاكل العلمية المماثلة. أولاً، عند قياس معدل إدماج لاميليبوديال سيتوسوليكالي فوتواكتيفاتيد البروتينات، على سبيل المثال، في ظروف تجريبية متميزة (كما هو موضح في ديمتشيف et al. 6)، ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة بين المجموعات التجريبية أحجام المناطق سيتوسوليك وعلى مسافات لحواف لاميليبوديال. من المهم أيضا النظر في ذلك عند مناطق سيتوسوليك فوتواكتيفاتينج، سمك الخلية أكبر في مواقف أقرب إلى النواة. قد ينتج عن تنشيط المناطق الخلوية سمكا كميات أعلى من البروتينات المنشط، نظراً لأن توزيع البروتين تنشيط المتجانس وتوزع في سيتوسول. وأخيراً، مستويات التعبير من البروتين لتفعيلها يمكن بالتأكيد اختلافاً كبيرا في الخلايا الفردية. نظراً لكل هذه الاعتبارات للتغير، من الأهمية بمكان لمقارنة مستويات التأسيس سيتوسوليكالي المنشط البروتينات في الخلية بالنسبة للأسفار الإجمالية التي تم الحصول عليها عند التنشيط في مناطق محددة في أماكن أخرى.
لقد قمنا بوصف كيف يمكن استخدامها كأداة للتحقيق في آثار البروتينات في الخلية مورفولوجيا microinjection وقد تجسد هذا بإظهار التعريفي قوية من هياكل لاميليبوديال في NIH3T3 ميكروينجيكتيد الخلايا تنتجها الخلايا الليفية مع GTPase Rac1 الصغيرة. نحن سابقا تطبيق هذا الأسلوب تتداخل مع الدالة Arp2/3 في الخلايا ميكروينجيكتيد مع المجال تضاعفت ج–المحطة الطرفية من الندبة/الموجه3. يمكن تحليل معلمات مختلفة في الخلايا ميكروينجيكتيد بفحوصات أخرى، مثل فراب أو فوتواكتيفيشن. لقد قمنا بوصف كيف يمكن أن تستخدم للتحقيق في ديناميات سوبسيلولار والتنقل من مونومرات أكتين فراب وفوتواكتيفيشن. فراب قد استخدمت مجموعتنا5 سابقا للتحقيق في الدوران من البروتينات إضفاء الطابع المحلي على لاميليبوديا، مثل بسب، وأبي، كورتاكتين، كوفيلين، ووضع حد أقصى للبروتين، أو لتوضيح دوران مكونات في الالتصاقات المحورية في الوجود ونظرا لغياب راك الإشارات4. وعلاوة على ذلك، يمكن إنجاز قياس معدلات بلمرة الأكتين فوتوبليتشينج معلم اجفب β-أكتين5، ولكن توجد طرق بديلة. كما يمكن تتبع إينهوموجينيتيس نيون كما يراها المسابير المتوافقة مع تصوير الخلية الحية وسم خيوط أكتين الخلوية، مثل ليفيكت25، العاملين6،في الفترة من26. الميزة هنا أنه يمكن تجنب overexpression من β-أكتين، التي قادرة على زيادة بروز حافة الخلية والهجرة، ومما يحتمل أن يتداخل مع المقايسة محددة أو مسألة تجريبية (انظر مثلاً كاجيه et al. 26؛ بيكهام et al. 27). بيد أن وضع غير مؤات متميزة للتحقيق ليفيكت تشكل السريع تشغيل/إيقاف حركية من ربط خيوط الأكتين، حيث أن تبيض هياكل خيوط أكتين المسمى من قبل ليفيكت في الخلايا يوفر معلومات فقط حول دوران التحقيق، لكن عدم دوران خيوط الأكتين، الذي كان يربط25. تتبع إينهوموجينيتيس fluorescence المستخدمة سابقا6،26 تقدم حلاً وسطا عمليا، أدرجت في الخيطية cytoskeletal مشابهة كثيرا للتتبع المستخدمة على نطاق واسع لتلامس الأسفار هياكل (انظر مثلاً، سمك السلمون، والملاح28)، ولكن قد لا تكون دقيقة قدر فراب الهياكل اجفب معلم واكتين وكما مستقيم إلى الأمام لاستخدام. وقد طبق فوتواكتيفيشن لنا لتقدير معدلات إدماج أكتين موحودي جاحظ لاميليبوديا، فضلا عن التنقل في جميع أنحاء سيتوسول، في سياق ضبطها تجريبيا سيتوسوليك أكتين و مستويات6. الأسلوب مفيد عند دراسة الحركة وتوزيع البروتينات المستمدة من مناطق كبيرة نسبيا، مثل مناطق سيتوسوليك. ومع ذلك، دراسة توزيع البروتينات المستمدة من هياكل فوتواكتيفاتيد صغيرة نسبيا؛ قد يكون مثلاً النمو الأقماع صعبة نظراً لانخفاض عدد جزيئات الفلورسنت المنشط، وإشارات ضعيفة، وهكذا الافتقار إلى الحساسية. وقد تشمل تقنيات بديلة محتملة إلى فوتواكتيفيشن أو فوتوكونفيرسيون للأسفار (انظر أعلاه) معكوس فراب، الذي يعتمد على فوتوبليتشينج الخلية بأكملها باستثناء العائد على الاستثمار، متبوعاً بتتبع حركة الجزيئات الفلورسنت بعيداً عن هذه المنطقة. هذه التقنية لا تتطلب overexpressing الإصدارات فوتواكتيفاتابل من البروتينات، ولكن سوف تنطوي دائماً على التعرض لجرعة عالية على نحو غير عادي من طاقة الليزر، يحتمل أن تسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل د.
ومن الواضح أن فوتواكتيفيشن وفراب لا يميز إذا كانت البروتينات تتحرك مونومرات، dimers، أو ليغومرات حتى الصغيرة، وعما إذا كانت تتحرك في تركيبة مع الشركاء ملزمة إضافية. يمكن الحصول على معلومات من هذا النوع بدلاً من ذلك من الأسفار ارتباط مطيافية تقنيات29 ، أو بدلاً من ذلك، بكى فليم30. ومع ذلك، فراب وفوتواكتيفيشن تشكل النهج واضحة لتقييم ديناميات البروتين المحلية والعالمية في الخلايا، بغض النظر عن البروتين الفائدة، موقع سوبسيلولار، أو نوع الخلية درس مباشرة.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لمؤسسة البحوث الألمانية (DFG) للدعم المالي (منحة رقم RO2414/5-1 إلى الخمير الحمر).
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |