Sur le site microbienne enrichissement ou in situ des techniques culturales peuvent faciliter l’isolement de difficile-à-culture microbiennes taxons, surtout des milieux de faible biomasse ou géochimique extrême. Nous décrivons ici un montage électrochimique sans utiliser de source d’alimentation externe pour enrichir des souches microbiennes capables de transport d’électrons extracellulaire (EET).
Respiration anaérobie couplée avec le transport des électrons à des minéraux insolubles (dénommé extracellulaire transport d’électrons [EET]) est considérée comme critique pour la production d’énergie microbienne et la persistance dans de nombreux environnements souterrains, en particulier ceux manque d’accepteurs d’électrons terminal soluble. Alors que les microbes EET compatibles ont été avec succès isolés provenant de divers milieux, la diversité des bactéries capables de EET est encore mal compris, surtout en difficile à l’échantillon, basse énergie ou des environnements extrêmes, comme bon nombre de sous-sol écosystèmes. Nous décrivons ici un système électrochimique sur place afin d’enrichir les bactéries EET-capable, en utilisant une anode comme accepteur terminal d’électron respiratoire. Cette anode est reliée à une cathode capable de catalyser la réduction de l’oxygène abiotiques. En comparant cette approche avec des méthodes d’electrocultivation qui utilisent un potentiostat pour car le potentiel de l’électrode, le système de deux électrodes ne nécessite pas de source d’alimentation externe. Nous présentons un exemple de notre enrichissement sur le site utilisé dans un étang alcalin aux Cèdres, un site de serpentinisation terrestres dans le nord de la Californie. Tentatives préalables de cultiver les bactéries réductrices minéraux ont échoué, ce qui est probablement dû à la nature de faible biomasse de ce site et/ou l’abondance relative faible de métal réduisant les microbes. Avant d’implémenter notre enrichissement de deux électrodes, nous avons mesuré le profil vertical de la concentration d’oxygène dissous. Ceci nous a permis de placer le carbone ressenti anode et plaqué de platine carbone estimaient processus cathodiques à des profondeurs qui appuieraient aérobie et anaérobie, respectivement. Après l’incubation sur place, nous avons enrichi l’électrode anodique en laboratoire et a confirmé une communauté microbienne distincte par rapport à la surface-jointe ou communautés de biofilm normalement observées aux Cèdres. Cet enrichissement a par la suite conduit à l’isolement du premier microbe électrogénique de cèdres. Cette méthode d’enrichissement microbienne sur place a le potentiel d’améliorer considérablement l’isolement de bactéries EET capable de biomasse faible ou difficile aux habitats de l’échantillon.
Plusieurs microbes réduction minérale ont démontré d’utiliser les minéraux en phase solide comme accepteur terminal d’électron, par des processus de transport des électrons extracellulaire (EET) qui effectuent des électrons à l’extérieur de la cellule par l’intermédiaire d’enzymes redox1. EET est essentielle, non seulement pour le microbe-minéral mais aussi l’énergie appliquée technologies et procédés environnementaux, tels que les piles à combustible microbiennes2, électrode synthèse3et4de la biorestauration. Nouvelles bactéries EET compatibles sont très recherchés et ont été largement étudiées d’un point de vue fondamentale ou appliquée5. Cependant, nous avons seulement limité aperçu de l’importance écologique ou biogéochimique de ces bactéries. La plupart des microbes EET compatibles ont été isolée après enrichissement d’aqua, sédiments ou des digesteurs anaérobies à l’aide des accepteurs d’électrons solides tels que MnO2, Fe2O3 ou électrodes prêtes en laboratoire6, 7 , 8. Toutefois, ces méthodes produisent souvent des consortiums similaires et potentiellement rater des taxons plus sensibles qui peuvent dominer à faible consommation d’énergie ou de systèmes de faible biomasse, polarisation de la capacité de ces microbes à s’adapter à la lab ou culture axénique environnement9 . Habituellement pour les environnements de faible biomasse, les grandes quantités d’eau provenant d’un site sont filtrées pour concentrer les cellules bactériennes. Cependant, EET-capable bactéries présentent souvent des métabolismes anaérobies et donc exposition oxygène peut également inhiber ou empêcher leur culture. Autres méthodes sur place à concentrer les cellules sans les exposer à l’oxygène pourraient faciliter l’isolement des bactéries EET-capable. Nous rapportons ici les détails de paramétrage concernant une technique électrochimique sur place afin d’enrichir le microbe EET-capable sur une longue période de temps sans la nécessité d’une source d’alimentation externe.
À l’aide de nos expériences d’electrocultivation provenant d’une source hautement alcaline en Californie du Nord, les cèdres10, les auteurs décrivent cette technique électrochimique sur place. La géochimie des ressorts à The Cedars sont affectées par la serpentinisation dans le sous-sol. Les ressorts sont très réductrices, avec la concentration d’oxygène inférieure à la limite de détection sous l’interface de l’eau air mettant en évidence le potentiel de production d’énergie microbienne par EET dans cet environnement anoxique fonctionnellement11. Cependant, il n’y a aucune preuve pour étayer les microbes EET capable des Cèdres (dans les ARNr 16 s ou analyse métagénomique). Même si cet environnement a été caractérisé comme accepteur d’électrons limitée, la possibilité d’utiliser les minéraux insolubles comme accepteurs d’électrons terminal, y compris les minéraux comme le fer, découvrant des minéraux qui résultent de la serpentinisation (c.-à-d., magnétite), n’a pas été intensivement étudié12. Nous avons, par conséquent, déployé notre système électrochimique au camping ressort, un pH élevé aux Cèdres, d’enrichir à EET capable de microbes (Figure1)13.
Dans l’étude décrite, nous montrons l’enrichissement d’un consortium microbien, lié avec in situ la production actuelle. Les tendances observées dans l’actuel soutien l’activité microbienne dans ce système au fil du temps de courte et longue échelles. L’étape critique pour la construction d’un système fonctionnel deux électrodes (type de pile à combustible) identifie et utilisant un emplacement avec une écurie de niveau d’eau et la concentration d’oxygène dans l’environnement. La…
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Roger Raiche et David McCrory nous permettant d’apporter les cèdres et la consultation sur les lieux pour l’incubation à long terme. Nous remercions également l’équipe de champ des Cèdres au cours de la saison 2013-2014 : Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam et Matthew Schechter. Supplémentaires grâce à Shino Suzuki et Gijs Kuenen recherche perspicace et prise en charge de la culture. Ce travail a été financé par une subvention pour jeunes scientifiques A et B de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant nombre 17H 04969 et 26810085, respectivement et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (17gm6010002h0002). Financement américain fourni par le US Bureau of Global Naval Research (N62909-17-1-2038) et le Centre pour les enquêtes de biosphère énergie sombre (C-DEBI) (OCE0939564) et la NASA Astrobiology Institute – vie souterraine (NAI-LU) (NNA13AA92A). Partie de ce travail a été réalisée dans le cadre d’une société japonaise pour la Promotion des Sciences : bourse de recherche postdoctorale à court terme pour Annette Rowe (PE15019) à l’Université de Tokyo, dans le laboratoire de Kazuhito Hashimoto.
Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |