Nous présentons ici un protocole pour produire un anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab dans Escherichia coli. La GPC3-S-Fab purifié a puissante cytotoxicité contre les cellules de cancer du foie positive GPC3.
Ce protocole décrit la construction et des études fonctionnelles d’un anticorps bispécifiques (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs peut reconnaître deux épitopes différents par le biais de leurs deux armes différentes. bsAbs ont été activement étudiées pour leur capacité à recruter directement des cellules immunitaires pour tuer les cellules tumorales. Actuellement, la plupart des bsAbs est produite sous forme de protéines recombinantes, soit comme contenant du Fc bsAbs ou comme petits bsAb dérivées sans la région Fc. Dans cette étude, GPC3-S-Fab, un anticorps bispécifiques base d’anticorps fragment (Fab), a été conçu en associant la Fab d’anticorps anti-GPC3 CG33 avec anticorps anti-CD16 domaine unique. La GPC3-S-Fab peut être exprimé chez Escherichia coli et purifié par chromatographie d’affinité deux. La GPC3-S-Fab purifié peut se lient à spécifiquement et tuent les cellules de cancer du foie positive GPC3 en recrutant des cellules tueuses naturelles, suggérant une application potentielle de GPC3-S-Fab dans le traitement du cancer du foie.
Anticorps monoclonaux sont maintenant largement utilisés pour le traitement de cancer1. En raison de la flexibilité des anticorps, différents formats de base d’anticorps ont été activement explorés. Par rapport aux anticorps monoclonaux, bsAbs présentent deux modules de liaison antigène différent, leur permettant de reconnaître les deux cibles différentes simultanément et efficacement déclenchent le recrutement des cellules effectrices immunitaire afin de cibler et de tuer des cellules de tumeur2.
Les formats actuels de bsAb recombinante peuvent être généralement attribués à deux classes : Fc contenant bsAbs et bsAbs sans une région Fc. Par rapport aux formats contenant des Fc qui sont produites principalement dans les cellules de mammifères, bsAbs sans une région Fc ont les avantages de plus petites tailles, sont plus facilement produits dans des systèmes d’expression micro-organisme et peuvent pénétrer les tissus tumoraux plus efficacement 3.
bsAbs sans une région Fc sont communément formés en reliant les moitiés de liaison individuels, tels que la variables chaîne unique fragments (scFvs) ou Fabs3. Sans les domaines stabilisantes, bsAbs basés sur des fragments de scFv souvent ont compromis la stabilité thermique, faible solubilité ou un risque accru d’agrégation4,5. En revanche, axée sur la Fab bsAbs sont plus stables en raison de l’hétérodimérisation du CH1 et CL dans le fragment Fab natif4,6.
Domaine variable de heavy-chain-seulement anticorps (HHV, aussi appelées anticorps à domaine unique) sont le fragment de liaison de l’antigène actif de chaîne lourde naturels anticorps7. HHV ont les caractéristiques de haute affinité, spécificité des classiques IgG8faible immunogénicité et des rendements élevés en expression bactérienne9. En comparaison avec des fragments de Fv, HHV ont plus élevé de stabilité thermique10. En comparaison avec les fragments Fab, HHV ont des tailles plus petites en raison de l’absence de CH1 et CL. Ainsi, les S-Fab, le format bsAb obtenu en associant la Fab d’un anticorps de domaine unique, VHH, a été conçu et étudié pour ses effets anti-tumoraux11,12.
Dans cette étude, la construction de GPC3-S-Fab en liant la Fab de hGC3313 avec un anti-CD16a VHH14 a été décrite. La GPC3-S-Fab peut être efficacement produit par expression périplasmique chez Escherichia coli (e. coli). Des études fonctionnelles de GPC3-S-Fab a suggéré que la GPC3-S-Fab est une stratégie prometteuse pour le traitement du cancer du foie. Ainsi, les avantages de GPC3-S-Fab sur des techniques alternatives avec références applicables aux études antérieures incluent production facile et purification et bsAbs plus stable.
Systèmes d’expression chez les mammifères et des systèmes d’expression procaryotes ont été utilisés pour exprimer les différents formats de BsAbs. Contrairement aux systèmes d’expression chez les mammifères, e. coli-systèmes d’expression de protéine de base ont beaucoup d’avantages, y compris avec des rendements élevés, faible coûts et allégeant, la facilité des manipulations génétiques et de transformation haute efficacité15. Pour bsAbs expression dans Escherichia coli, il y a deux stratégies de base : expression dans le cytoplasme et l’expression dans le périplasme entre le cytoplasme et la membrane cellulaire externe15. Par rapport à l’environnement réducteur du cytoplasme, le périplasme est un oxydant plus environnement qui favorise le repliement correct et la co-expression de protéines16. Un pliage correct joue un rôle clé dans la solubilité, stabilité et la fonction de génération de bsAbs. Par conséquent, un signal séquence pelB a été ajouté à la N-terminale de la S-Fab pour diriger la sécrétion pour le périplasme des e. coli17. Afin d’assurer bon pliage, solubilité, stabilité thermique et la stabilité conformationnelle, réduisant la complexité et la taille d’un anticorps est fréquemment employé16. Le format S-Fab comprend un Fab et un VHH, qui s’exprime très bien dans les systèmes bactériens probables due à la structure simple et de petite taille.
GPC3 a été choisi dans ce format d’anticorps bispécifiques GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) est un membre de la famille de protéoglycanes héparine sulfate (HS) qui est ancrée à la surface des cellules via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 est surexprimée dans 70 % des cas de hepatocellular carcinoma (HCC), qui représentent la majorité des cancers du foie19,20,21,22. Car GPC3 est rarement exprimée dans les tissus normaux, GPC3 a été proposé comme une cible potentielle pour HCC. Plusieurs souris mAbs ont été produites contre GPC3. Cependant, seulement CG33 présentait l’activité anti-tumorale limitée 22, et il n’a pas à exposer une efficacité clinique chez les patients. Dans cette étude, GPC3-S-Fab s’est avéré être en mesure de recruter les cellules NK pour tuer GPC3 tumeur cellules14.
Pour recruter des cellules NK, anti-CD16 VHH a été utilisé. CD16a est un récepteur de faible affinité IgG, exprimé principalement sur certains sous-types de cellules T, les macrophages, les monocytes et les cellules tueuses naturelles (NK). Il est impliqué dans la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) par NK cellules23. Les cellules NK humains peuvent être classés en deux types, CD56 – CD16 + et CD56 + CD16-. Contrairement aux cellules CD56 + CD16− NK, CD56-cellules NK CD16 + peuvent libérer des niveaux plus élevés de la perforine et granzyme B et donc présenter une forte cytotoxicité24. Des cellules de Kupffer (KCs), exprimant les CD16a, sont les macrophages résidents dans le foie. Des cellules de Kupffer jouent un rôle important dans la répression d’un cancer du foie,25. Ainsi, bsAbs CD16a de ciblage peut être une stratégie plus prometteuse que se livrer à des lymphocytes T contre le cancer du foie.
Dans cette étude, nous présentons une stratégie visant à construire un nouveau format de bsAbs, GPC3-S-Fab, qui peut recruter des cellules NK, ciblant les cellules tumorales positif GPC3. Le S-Fab est basé sur la Fab naturel format en ajoutant un anti-CD16 VHH11,12. Par rapport à la région de Fc contenant bsAbs, GPC3-S-Fab peut facilement être produit dans le périplasme des bactéries sur une grande échelle.
À l’aide de la…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu financièrement par la R & D Plan de la Province du Guangdong (Chine) (2016A050503028).
Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
DMEM | Gibco | C11995500CP | |
RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
Glycine | aladdin | A110752-500g | |
KCl | aladdin | P112134-500g | |
MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
25cm2 flask | Corning | 430639 | |
96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
NK92 | ATCC | CRL2408 |