Summary

Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.

Abstract

De huid is een zeer uitgebreide orgaan van het lichaam en, als gevolg van deze grote oppervlakte, het is voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Huid schade kan gemakkelijk leiden tot infecties in de dermis die kan, op hun beurt in de verspreiding van ziekteverwekkers in de bloedbaan resulteren. Inzicht in hoe het immuunsysteem vecht infecties in de zeer vroeg stadium en hoe de host kunt elimineren de ziekteverwekkers is een belangrijke stap om de basis voor toekomstige therapeutische interventies. Hier beschrijven we een model van Candida albicans infectie die de processen die zich tijdens een infectie voordoen, met inbegrip van wanneer het pathogene agens is verstreken, de epitheliale barrière, evenals de immune reactie ontlokte door de C. albicans vroeg kunt visualiseren invasie. We gebruikten deze infectie model histologische analyses die aantonen dat de immuuncellen die infiltreren in de huid, evenals de aanwezigheid en de lokalisatie van het pathogene agens uitvoeren. Monsters genomen nadat de infectie kan worden verwerkt voor RNA extractie.

Introduction

Het menselijk lichaam is bedekt met een extreem hoog aantal micro-organismen. De oppervlakte van de huid is de habitat van bijna een miljoen bacteriën per vierkante centimeter1. Dit nummer, echter overeen niet met het volledige scala aan micro-organismen die de huid koloniseert. Naast bacteriën, is het menselijk lichaam gekoloniseerd door vele schimmel soorten, met inbegrip van C. albicans, die in staat zijn om te overleven op de mucosa en de huid niveau2is.

In de afgelopen jaren is het percentage van de mensen gediagnosticeerd met schimmelinfecties enorm toegenomen. Dat komt vooral door het hogere aantal immuungecompromitteerde personen, dat wil zeggen, HIV-positieve patiënten en patiënten die zijn gegaan door chemotherapie of Immunosuppressieve medicijnen na transplantatie3. In een surveillance studie, uitgevoerd in de Verenigde Staten, toonde Wisplinghoff et al. dat 9,5% van de nosocomiale bloedbaan infecties werden veroorzaakt door Candida soorten4. Als gevolg van het toegenomen voorkomen van schimmelinfecties, en met name vanwege het verhoogde percentage van Candida -soorten infecties van de bloedbaan geconstateerde, is begrijpen hoe deze ziekteverwekker ontsnapt aan de controle van het immuunsysteem zeer belangrijk.

C. albicans is een dimorphic schimmel die in verschillende morfologische vormen zoals gist, blastospores, pseudohyphae en schimmeldraden afhankelijk van de omgevingsomstandigheden5 groeit. In zijn hyphal vorm, C. albicans toont van zijn hoogste capaciteit van invasiviteit en heeft de mogelijkheid om te penetreren het epitheel6.

C. albicans infecties zijn bestudeerd met behulp van verschillende experimentele benaderingen. Het meest voorkomende model van infectie is de intraveneuze injectie van C. albicans gist7. Echter houdt dit model niet rekening alle processen die gebeuren voordat de schimmel beheert te verspreiden in de bloedbaan. Een ander model maakt gebruik van de mogelijkheid van C. albicans invasie van het epithelium. Deze methode, ook bekend als het schuurpapier model8, werd ontwikkeld door Gaspari et al. in 19989, en bestaat uit het gebruik van schuurpapier aan de huid, waardoor het stratum corneum alvorens C. albicansabrade. Deze procedure kan de schimmel te doordringen van het epitheel, waardoor de analyse van de invasieve capaciteiten van deze pathogenen. Tot slot, andere modellen van infecties voor de gastro-intestinale10 en11 van de luchtwegen zijn gebruikt in verschillende studies.

De vorming van een wond (zoals in het schuurpapier model) zorgt ervoor dat de activering van verschillende opleidingstrajecten, met inbegrip van immuun cel aanwerving en activering, teneinde het helende proces12. Dit kan veranderen of maskeren de immuunrespons specifiek ontlokte tegen de ziekteverwekker, waardoor verstorende resultaten.

Hier beschrijven we een methode van huidinfectie die eerste wond vorming vermijdt en de inductie van een basale inflammatoire omgeving. Als u wilt behouden de intact epitheliale structuur, injecteren we direct C. albicans in zijn hyphal vorm in de diepe derma. Hoewel een enkele injectie milde ontsteking uitlokken kan, het bedrag van de ontsteking is beperkt en beperkt in vergelijking tot de vorming van een open wond in de zand papieren model. De aanpak die we hier beschrijven maakt het mogelijk de studie van de immuunrespons voor schimmelinfectie en verspreiding terwijl het vermijden van de buitensporige en reeds bestaande inflammatoire omgeving veroorzaakt door mechanische schade.

Protocol

Alles wat de procedures waren goedgekeurd onder de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en geëxploiteerd onder toezicht van de Vakgroep dierlijke bronnen op kinderen’s ziekenhuis (boog) in Boston Children’s Hospital of goedgekeurd door de Italiaanse Ministerie van volksgezondheid en verricht op grond van de institutionele Animal Care Comité bij de Universiteit van Milaan-Bicocca. 1. C. albicans voorbereiding Cultuur C. albicans, stam CAF3-1<sup cl…

Representative Results

Door de injectie van het pathogene agens rechtstreeks in de diepe derma blijft de structurele morfologie van het weefsel intact (figuur 1A). De handhaving van de structurele integriteit van de huid kan de detectie van immune cellen en hun lokalisatie op de site van infectie. De hogere vergroting weergegeven in figuur 1B onthult dat het abces bestaat voornamelijk uit pol…

Discussion

Hier beschreven we een methode van C. albicans infectie te bestuderen van het inflammatoire proces dat wordt gestart bij de ingang van de schimmel in de diepe derma.

Hoewel huid abces formatie een relatief zeldzame gebeurtenis op C. albicans infectie15 is, kan injectie van de schimmel direct in de diepe derma niet alleen de studie van fungale gestuurde abces vorming, maar ook de analyse van specifieke immune cellen die deel uitmaken van bevatten schimm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

FG wordt ondersteund door de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) en Fondazione Regionale per la Ricerca Henelit (FRRB).
IZ wordt ondersteund door de NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton gevonden, CCFA Senior Research Awards (412708), de Eleanor en Miles Shore 50e verjaardag Fellowship-programma, en de Cariplo Foundation ( 2014-0859).

Materials

Reagents
PBS Euroclone ECB4053L warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound histo-line laboratories R0030
Gill's Hematoxilyn histo-line laboratories 09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic histo-line laboratories 09-209-05
Ethanol absolute scharlau ET00232500
Citro-HISTOCLEAR histo-line laboratories R0050
Eukitt, mounting medium bio-optica
Acetone sigma-aldrich 179124
PAS staining system sigma-aldrich 395B-1KT
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast Extract BD 212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology Applichem PanReac 50-99-7
Uridine Merck Millipore 8451
HEPES Applichem PanReac A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL eppendorf 30121597
TRIzol Reagent Life Technologies 15596018 Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104
liquid nitrogen Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat histo-line laboratories
TissueLiser QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle  BD 324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable histo-line laboratories 2781
Positively charged bio microscope slides bio-optica 09-2000
Cover slips 24 x 50 mm thermo scientific 11911998

References

  1. Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
  2. Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
  3. Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
  4. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  5. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
  6. Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
  7. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
  8. Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
  9. Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
  10. Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
  11. Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
  12. Leoni, G., Neumann, P. -. A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
  13. Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
  14. Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
  15. Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
  16. Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
  17. Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).

Play Video

Cite This Article
Santus, W., Mingozzi, F., Vai, M., Granucci, F., Zanoni, I. Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (136), e57574, doi:10.3791/57574 (2018).

View Video