מודל פציעה דרוזופילה In Vivo ללמוד Neuroregeneration ב ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שימוש דרוזופילה נוירון חישה – דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם, אשר משלב ויוו לחיות הדמיה, שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy ואת הכלים גנטי לטוס עוצמה, פלטפורמה לסינון היזמים הפוטנציאליים, מעכבי של neuroregeneration.
Abstract
היכולת לצמיחה מחודשת של נוירונים פגום מושלת neuroregeneration ושחזור פונקציונלי אחרי טראומה מערכת העצבים. במהלך העשורים האחרונים, זוהו פנימי ולא חיצוני מעכבות גורמים שונים המעורבים ההגבלה של האקסון התחדשות. עם זאת, הסרת רמזים מעכבות אלה אינו מספיק מוצלח ההתחדשות, המצביע על קיומן של מכונות רגולטוריות נוספות. דרוזופילה melanogaster, זבוב הפירות, חולק גנים שנשמרת אבולוציונית, איתות המסלולים עם בעלי חוליות, כולל בני אדם. שילוב הכלים גנטי רב עוצמה של הזבובים עם שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy, נתאר כאן דרוזופילה נוירון חישה – דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם כפלטפורמה לסינון באופן שיטתי על הרומן התחדשות הרגולטורים. בקצרה, זו הפרדיגמה כולל a) הכנה של הזחלים, ב) הנגע אינדוקציה dendrite(s) או axon(s) באמצעות לייזר שני הפוטונים, ג) בשידור חי קונאפוקלית הדמיה לאחר פציעה ד) ניתוח ממצאים. המודל שלנו מאפשר פגיעה מאוד לשחזור של נוירונים שכותרתו יחיד, אקסונים ו דנדריטים של תתי סוגים עצביים מוגדרים היטב, הן ציוד היקפי והן במערכת העצבים המרכזית.
Introduction
חוסר היכולת של אקסונים להתחדש לאחר פציעה מערכת העצבים המרכזית (CNS), עלול להוביל נכות קבועה בחולים, גם משחק תפקיד גרעונות בלתי הפיך ניווניות מחלות1,2 ,3,4,5. הסביבה מערכת העצבים המרכזית, כמו גם יכולת גידול מהותי של נוירונים, קובע אם אקסונים מסוגלים להתחדש לאחר טראומה. גורמים חוץ-תאית וממקורות אוליגודנדרוציטים, astroglial, fibroblastic הוכחו לעכב צמיחה עצביים4,6,7,8, אבל חיסול של מולקולות אלה רק מאפשר מוגבלת הלבלוב5. התחדשות פנימית אותות יכול להשפיע על הצלחה משובי5,9 ומייצגים מטרות טיפוליות אפשריות, אך תהליכים אלה הם עדיין לא מוגדר היטב ברמה המולקולרית. העלאות עם מחלות גורם איתות או חיסול של בלמים אנדוגני, כגון פוספטאז Pten10, יכול לגרום התחדשות עצב בנסיבות מסוימות. שילובים של שיטות שונות נמצא יעיל באופן אינדיבידואלי מספקים גם רק ההתאוששות הכללית מוגבל עד כה11,12,13,14. לכן, אין צורך נואש כדי לזהות מסלולים נוספים לטיפול ממוקד. בנוסף אתחול של האקסון לצמיחה מחודשת, אם וכיצד אקסונים תיל מחדש אל המטרה הנכונה, הרפורמה סינפסה, ירידה לפרטים, ולהשיג שחזור פונקציונלי חשוב שאלות בלתי פתורות.
לסיכום, ההבנה הנוכחית של מכונות הכתבת התחדשות האקסון הוא עדיין מאד וכלליות. חלק מהבעיה היא הקושי הטכני של הלומדים האקסון התחדשות ביונקים בזמן אמת, גישה זה יקר, גוזלת זמן, ומאתגר עבור ניצוח מסכי גנטי בקנה מידה גדול. דרוזופילה melanogaster, מצד שני, הוכיחה להיות מערכת חזק לחקר שאלות ביולוגיות מורכבות. זבוב הפירות כבר אינסטרומנטלי הגדרת גנים והאיתות מסלולים זה נשמרים להפליא בבני אדם, היה מודל מוצלח לצורך המחקר של מחלות אנושיות, כמו מחלות ניווניות, דרך הכלים העצום גנטיקה מולקולרית זמין לתמרן ג’ין פונקציה15. בפרט, זבובי פירות, נחשבת כלי אידיאלי עבור גילוי גנים המעורבים פגיעה עצבית ו לצמיחה מחודשת15,16. פותחו מספר מודלים לטוס פגיעה עצבית, כולל ראש-מבוגר או עצב הגחון זחל כבל (VNC) לדקור עם מחטים, זחל VNC או עצב מעוך עם מלקחיים, נוירון זחל axotomy לייזר, הסרת נוירון קולטני ריח, פגיעה מוחית explants, פגיעה במערכת העצבים ההיקפית על ידי אגף פיצויי15,17,18,19,20,21,22,23. . Excitingly, זה התבצעה עבודה ניצול דרוזופילה פציעה מודלים המתקדמת ההבנה שלנו של המסלולים הסלולר ותעשיה בשימוש על ידי מערכת העצבים להגיב לפגיעה עצבית, אשר הוכחו להיות שמור ב יונקים24 ,25. שוב, זה מדגיש את התועלת של זה אורגניזם מודל עבור זיהוי מנגנוני תיקון עצבי הרומן.
המתוארים כאן הוא שני הפוטונים מבוססת לייזר דרוזופילה נוירון חישה זחל פציעה מודל. לייזר שני הפוטונים השימוש הראשון היה לחתוך אקסונים דג זברה ויוו 200326. באותה שנה, dendriotomy לייזר הראשונה בוצעה בשנת דרוזופילה באמצעות לייזר של חנקן פעמו27. זמן קצר לאחר מכן, מספר מעבדות C. elegans להשתמש לייזר הפמטו-שנייה כדי ליצור מודלים של האקסון התחדשות28. ב- 2007, וו ועמיתיו בהשוואה ודיווח על ההבדלים בין פציעות לייזר ב- C. elegans המושרה על ידי סוגים שונים של לייזרים29. בשנת 2010, האקסון חידוש לאחר לייזר axotomy הוצג לראשונה להופיע אצל דרוזופילה30. בהתבסס על ספרות זו פגיעה נרחב לייזר, פיתחנו מודל פגיעה עצבית לעוף באמצעות הלייזר שני הפוטונים, המאפשר אינדוקציה מדויק לפגיעה אתרי יישוב עם ההפרעות מינימלי של רקמות שכנות, מתן יחסית נקי מערכת ללמוד בשני המאפיינים פנימי ולא חיצוני של neuroregeneration עם רזולוציה תא בודד. באופן ספציפי, הקמנו קבוצת שיטות הפציעה arborization דנדריטים (da) החישה הניריונים, הן מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) ואת מערכת העצבים המרכזית. ניתן לקבץ Da נוירונים ארבע כיתות נפרדות מאופיינת בעיקר המורכבות מסעף שלהם דנדריט: מחלקה אני הרביעי31. עבודתנו שפורסמו מראה כי דה נוירון התחדשות דומה מודלים בתרבית של פגיעה ברמת פנוטיפי ו מולקולרית: da נוירונים להציג מאפייני מחלקה של התחדשות מסוימת, עם מחלקה IV אבל לא כיתה אני או נוירונים da השלישי מפגין התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית; השיעור הרביעי da נוירון אקסונים להתחדש robustly בפריפריה, אבל פוטנציאל הרגנרציה שלהם מופחת באופן דרמטי מערכת העצבים המרכזית, ובכך דמוי שורש העזוב נוירונים גנגליון (DRG) ביונקים; שיפור הפעילות mTOR באמצעות Pten מחיקה או ביטוי Akt משפר האקסון התחדשות של הזבוב CNS19. ניצול מודל זה פגיעה, אנו להיות ביצוע מסכי גנטי, זיהו את האנזים עיבוד RNA rtca ב גורם מעכבות אבולוציונית שנשמרת האקסון ההתחדשות, קישור האקסון פציעת מתח סלולר והסבת RNA20 .
ב התבנית שהוצגו, הפגיעה הנגרמת באמצעות לייזר axotomy/dendriotomy של הזחל class IV או נוירונים da השלישי, הנקרא על-ידי ממ ק-CD4-tdGFP או 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, ריפו-Gal80, בהתאמה. הפגיעה מבוצעת 2nd כדי 3rd הזחלים לחלל כ 48-72 שעות לאחר הנחת (h AEL) ביצה. עבור מערכת העצבים ההיקפית axotomy הנגע מכוון למקטע של האקסון ~ 20-50 מיקרומטר, והגוף תא, CNS axotomy לאזור של ~ 20 מיקרומטר בקוטר בצומת commissure ב VNC, ולכל dendriotomy על נקודות סניף ראשי דנדריטים. באותו הנוירון זה עם תמונה 8-24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר חיתוך מלאה, ובבית 48-72 h AI כדי להעריך את התחדשות. באמצעות הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, ניוון של התחדשות של אקסונים/דנדריטים בודדים שהיו פצועים ויוו ניתן לנטר לאורך זמן.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת הגדרת הזבוב חוצה, המספר של נקבות וזכרים בשימוש יכולה להשתנות בהתאם אחרים את המספר של הזחלים לצורך ניסויים ספציפיים בבעלי. WT זבובים, הצלב טיפוסי משתמש 10 נקבות וזכרים 5. החלון אוסף עשוי להצטמצם, בהתאם למידת הדיוק של עידן הזחלים נדרש. לדוגמה, פרק 2-h אוסף תניב הזחלים של אוכלוסיה הומוגני יותר….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ג’סיקה Goldshteyn לקבלת תמיכה טכנית. העבודה במעבדה השיר ממומן על ידי המענק-NIH R00NS088211, ואת הקניין הרוחני פרס לפיתוח תוכנית חדשה מרכז מחקר התפתחותיות (IDDRC).
Materials
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. . Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?. Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
