氨纤维膨胀(AFEX)是一种热化学预处理技术,可将木体纤维素生物量(如玉米制积器、稻草和甘蔗渣)转化为生物燃料和动物饲料应用的高度可消化原料。在这里,我们描述了一种实验室规模的方法,用于对利诺纤维素生物量进行AFEX预处理。
利诺纤维素材料是植物衍生的原料,如作物残留物(如玉米制虫、稻草和甘蔗渣)和专用能源作物(如杂物和转草),大量可用于生产生物燃料、生化和动物饲料。细胞壁内嵌的植物多糖(即纤维素、纤维素和果胶)对转化为有用的产品非常顽固。氨纤维膨胀(AFEX)是一种热化学预处理,它提高了多糖到酶的可及性,用于水解成发酵糖。这些释放的糖可以在生物精炼厂中转化为燃料和化学品。在这里,我们描述了一个实验室规模的批次AFEX工艺,用于在克表上生产经过预处理的生物量,无需任何氨回收。实验室规模工艺可用于识别最佳预处理条件(例如氨载荷、水负荷、生物质载荷、温度、压力、停留时间等),并生成足够数量的预处理样品,用于详细的物理化学表征和酶/微生物分析。使用实验室级AFEX工艺预处理的玉米菌溶性水解产生的可发酵糖产量与类似预处理条件下的试验级AFEX工艺相当。本文旨在为实验室级反应堆的安全、一致地运行提供详细的标准操作程序,用于对结核纤维素生物量进行AFEX预处理。
氨纤维膨胀(AFEX)是一种热化学预处理,以挥发性氨为主要反应物,用于纤维素生物量预处理。这个过程最初是由布鲁斯·戴尔发明的,目的是以经济方式有效地减少利诺塞洛西生物量的顽固性,并将生物催化预处理的生物量解构转化为可发酵糖11,2。2与大多数其他水基热化学预处理3不同,AFEX是一种干干过程,在生物质成分上不会产生显著变化,并且不需要与相关的废物产生和费用一起清洗步骤。在试验规模上已经证明了过量挥发性氨的回收,从而减少了废物的产生和加工成本。MBI开发的试验式包装床AFEX反应系统(图1)使用蒸汽剥离回收残余氨,并将热浓缩氨转移到新的包装床4,4,5。在AFEX预处理后,少量氮纳入生物质,由反胃动物和微生物用作非蛋白质氮。此外,通过改变生物量超结构通过各种物理化学机制6,6,7,8,AFEX增加生物量对碳水化合物活性酶(CAZymes)的可及性,并将多糖水解率提高几倍7,88,9,9这也增加了反胃动物通过其纤维8化微生物群4,10,11,1210,11,12的消化能力。4长期以来,农民一直采用这种方法的更简单版本,通过在低无水氨负荷(+lt;4% 和干生物量基础)和环境压力和温度10,11,11的情况下,在塑料油布下孵育生物量数天或数周,提高反胃动物的消化能力。
无水氨在20世纪50年代首次被调查为可能伪造木材,并在1970年代早期作为制浆化学品,在13,14,15,16,17,18。13,14,15,16,17,18在20世纪80年代初,在亚临界条件下首次使用加压、高温、浓缩氨(>30%NH4OH),以提高利诺纤维素生物量19的酶消化性和微生物发酵性。这个过程经历了几个名称的变化,多年来,从氨冻结爆炸,然后氨纤维爆炸,最后,氨纤维膨胀,或简单的AFEX。大约在同一时间(20世纪80年代中期),杜邦(现为陶氏-杜邦)也探索采用超临界和近临界无水氨预处理工艺,以提高生物量20、21、2221,22的消化能力。20近几十年来,人们日益重视使用稀释水氨溶液作为预处理试剂,包括氨回收/渗透23(ARP)、浸泡在23水氨(SAA)或陶氏-杜邦工艺中,无氨回收24。其他几种方法研究使用无水氨(低水分无水氨(LMAA)和低液氨预处理25。在过去几年中, 最近研制出两种利用液无水氨26、2727和氨盐基溶液的新型先进有机素式预处理技术,在高液到固体负荷26下,在超低酶载荷下,可选择性木质素分馏和高效酶水解预处理纤维素生物量。最近一篇评论文章强调了各种形式的氨基预处理方式之间的相似性和明显差异29。然而,直到最近4年,还没有试验规模的氨基预处理工艺(如AFEX)有效地与封闭循环化学回收集中氨使用的过程。
在本文中,我们详细介绍了最常用的AFEX协议,用于在实验室尺度上预处理纤维素生物量,以产生经过预处理的生物量的克尺度(例如,1至几100克)。通常,生物质与水混合(0.1~2.0 g H2O/g 干生物量),并加载到定制的不锈钢管状或帕尔型反应堆中。然后,将无水氨(0.3~2.0 g NH3/g 干生物量)添加到反应器中,将混合物加热到所需的反应温度(60~180°C)。1980-1990年代AFEX工艺的早期出版物在温度升高后立即启动了预处理居住时间(例如5-60分钟)。然而,当氨添加到反应器后,反应就会发生,目前的AFEX程序是在向反应器添加氨后立即开始监测停留时间。对于 90°C 或更高的温度,通常需要在装载氨之前预热生物质,以使初始温度上升到最短的时间段(即 <5 分钟)。在停留时间完成时,阀门打开以快速释放压力,并将气相含量放入合适的化学烟气罩中。氨从液体到气相的快速转换也使反应器冷却。小型反应堆(100 mL反应堆体积)可能需要额外的冷却时间。为了用户安全,在更大范围内(每台反应器运行的100克氨),建议用氮气清除尽可能多的残余氨,并在卸载前帮助冷却反应器内容物。通常,在实验室规模上不尝试回收和/或回收氨。扩大AFEX预处理工艺的关键设计挑战之一是以最低的资本和运营成本回收氨。此外,在生物质中添加液氨通常会导致冷却生物量的液体部分闪烁,需要在AFEX处理开始之前加热生物质-氨混合物。在生物质中添加氨蒸气不是添加氨,而是具有两个优点:第一,散装生物质的高孔隙度允许氨蒸气快速输送,甚至导致氨在整个生物质中分布。其次,氨蒸气容易和蒸发溶解到潮湿的生物量中,从而产生热能迅速均匀地加热生物质。为了利用这些优势,MSU Dale 实验室和 MBI 都开发了使用氨蒸气的 AFEX 处理方法。戴尔实验室开发了气态氨预处理(GAP)工艺30,MBI开发了包装床AFEX反应器工艺(图1)4,已在试验规模上4进行了演示。包装床AFEX反应器系统能够半批量模式运行,使用蒸汽剥离方法44、55完全回收氨。这种新型的MBI试验规模工艺利用氨的化学和物理特性,在高效回收氨的同时,有效地预处理生物质。
在这里,我们介绍了使用定制的200mL体积管状反应器在实验室规模下对玉米定木进行AFEX预处理的详细大纲(图2)。AFEX 预处理样品被消化成可发酵糖,使用市售的纤维解酶鸡尾酒来证明预处理过程的有效性。实验室级AFEX反应堆的酶水解结果与较大的试验级AFEX反应堆产生的样品进行了比较。我们的目标是为实验室级加压反应堆的安全和一致运行提供标准操作程序,以便对玉米烤架等纤维素生物量进行AFEX预处理。有关此实验室级 AFEX 预处理过程(例如,试点式包装床 AFEX 流程)变化的其他支持信息,在随附的补充 pdf 文件中进一步突出显示。有关包装床 AFEX 流程操作步骤的详细报告将在单独的出版物中突出显示,并可应 MBI-MSU 的请求提供。
AFEX 协议描述了如何在高温度下在无水氨和水存在的情况下处理植物材料,以提高纤维解酶和/或微生物预处理材料的消化性。AFEX在克霉素单体品种(例如,玉米制虫、转草、虫草、稻草、麦秆和甘蔗渣)上非常有效,因为在这些材料中天然丰富的酯状连接的过程效率很高。AFEX在从二甲醚和健身房(硬木、软木和本地杏)衍生的生物量上效率要低得多,32,33,,33因为基于木质素碳水化合物的酯链比例较小。然而,当这些联系被引入木本细胞壁使用植物生物技术,AFEX预处理过程变得更加有效34。
酯链的裂解允许从材料中去除某些生物量成分,但作为提取物重新沉积在外细胞壁表面,形成纳米级孔,促进纤维解酶的渗透和作用6。AFEX 预处理的玉米质质后,与未经处理的材料相比,在高固体条件下酶水解后,葡萄糖和木糖的释放率大约增加了3倍。与稀酸预处理35相比,氨预处理产生的抑制降解产物更少,抑制性降低。先前对AFEX和稀酸处理玉米炉的比较显示,稀酸预处理产生的酸含量比AFEX36多316%,芳烃多142%,furan醛含量增加3,555%,所有这些都可以抑制微生物35,37。,37由于 AFEX 是一个干到干的过程,因此在酶水解过程中,糖作为稀释的液体流不会损失。然而,这确实会导致并发症,因为具有纤维素降解和半纤维素降解能力的酶需要在酶水解期间完全分解细胞壁多糖,转化为葡萄糖和木糖等混合发酵糖。据报道,血红素寡聚物抑制纤维素活性38,这可能需要更高的酶负荷,以保持高最终糖产量。然而,优化合适的酶鸡尾酒可以减少AFEX预处理生物量39、40、41、42、43、44、45的糖化过程中的整体酶使用。39,40,41,42,43,44,45在AFEX预处理过程中,酯连接的水解和氨基酶解导致预处理生物量(如醋酸/乙酰胺、铁氧体酸/硫酰胺、焦马酸/焦霉酰胺)36中酸和酰胺产物的形成。虽然内层的形成已被证明有助于发酵过程,但如果喂养动物预先处理过生物马,它们在预处理原料中浓度非常高可能是一个问题。在AFEX预处理之前,与碱(如NaOH或Ca(OH)2等2 酯链的预水解可用于解决问题。
在 AFEX 过程中使用无水氨时,需要考虑许多安全注意事项。无水氨与密封中使用的铜、黄铜、铝、碳钢和常用氟弹性聚合物(如 Viton 等)发生反应。任何可能接触氨的管或反应器部件都应由不锈钢制成,并且垫片、阀座和快速连接密封件应尽可能由特氟龙或 Kalrez 制成。氨不被认为是一种有毒的化学物质,但它仍然是危险的,因为它的吸湿和低温性能。它很容易瞄准并严重损害眼睛和呼吸系统的粘膜。氨是一种低温流体,氨泄漏会由于与气流或冷冻设备直接接触而造成严重的冻伤。氨在浓度超过 300 ppm 时立即对生命和健康 (IDLH) 造成危险。如果浓度超过 50 ppm,工人应立即撤离。建议操作员佩戴校准的氨监测仪,以警告其附近存在危险浓度。还建议在主工作区安装带报警器的传感器。处理氨的工人应接受适当培训,并佩戴防护装备,如装有甲基胺盒的逃生呼吸器、低温和防热手套,并做好应对紧急情况的准备。如果接触无水氨,操作员应转移到安全地带,并立即向受影响区域冲水至少 15 分钟。氨预处理过程应在烟气罩内进行,氨气瓶应储存在通风罩或通风柜中。实验后,经过预处理的生物量将具有一些残留的游气氨,应在发动机罩中干燥过夜或在定制通风干燥箱中干燥,然后储存在室温的塑料袋中进行后续实验。其他一些关键安全注意事项包括安装带有流量计的氨输送系统,以帮助精确向反应器输送氨,以及设计处理预处理过程压力至少 1.5 倍的反应堆(例如,在 2 x 106 Pa 压力下处理 AFEX 过程,反应器的最低压力额定值应为 3 x 106 Pa)。
AFEX 预处理是生产高度可消化的植物生物量的有前途的方法,可以直接用作动物饲料或作为原料来产生燃料和化学品。除了这两个行业之外,AFEX 可能还会在其他领域使用,例如生物可再生原料生产生物材料,或用作生产沼气的原料。实验室规模过程可以在配备适当通风空间和安全预防措施的实验室中进行,我们目前的工作证实,这种缩小的AFEX工艺与放大和/或试验式AFEX反应堆中产生的材料相似。实验室规模的 AFEX 流程可用于以更高的吞吐量方式测试原料、处理条件和应用程序,同时对该流程在试点或工业规模下的性能提供合理的预期。
The authors have nothing to disclose.
本材料部分基于五大湖生物能源研究中心、美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室(编号为 DE-SC0018409 和 DE-FC02-07ER64494)的工作。丽贝卡·翁承认密歇根州理工大学(启动资金)的部分支持。Shishir Chundawat 承认美国国家科学基金会 CBET 奖 (1604421)、ORAU 拉尔夫·波韦奖和罗格斯工程学院(启动资金)的部分支持。Bruce Dale 承认密歇根州立大学 AgBio 研究办公室以及美国农业部国家粮食和农业研究所的部分支持。文卡泰什·巴兰承认得克萨斯州和休斯敦大学(创业基金)的部分支持。MBI 员工承认美国能源部和密歇根州立大学基金会的部分支持。最后,我们谨将本文献给我们的导师和合著者布鲁斯·戴尔教授,以激励我们共同追求我们创造可持续纤维素生物燃料的梦想。
Safety Equipment/PPE | |||
Ammonia Monitor | CanarySense | BW GAXT-A-DL | Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm |
Cryogenic gloves | Amazon | B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 | Keep hands protected when handling liquid ammonia |
Ear muffs | 3M | H7A | Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment |
Face shield | – | – | Wear while handling ammonia |
Heat protective gloves | Grainger | 2EWX1/2EWX2/2EWX3 | Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F |
Nitrile gloves | – | – | Wear while mixing biomass to prevent contamination |
Reagents | |||
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder | – | – | An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder. |
Distilled water | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Milled or Chopped Corn Stover | – | – | Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some. |
Nitrogen Compressed Gas Cylinder | – | – | |
Equipment | |||
Ammonia Cylinder Adapter | – | – | CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia. |
Ammonia Delivery System (Figure 4) | Swagelok | Misc. | Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia. |
Analytical Balance | Sartorius | CPA4202S | Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g |
Chemraz O-rings | Harvard Apparatus | 5013091 | Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe |
Custom Tubular Reactors (Figure 3) | Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) | Misc. | To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps. |
Drying Box | – | – | Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures. |
High Pressure Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3311 | Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia |
Moisture Analyzer | Sartorius | MA35 | Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment. |
Nitrogen Delivery | Misc. | Misc. | Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves. |
Ratchet wrench and 7/8" socket | – | – | Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere. |
Retractable Thermocouple Cables | Omega | RSC-K-3-4-5 | Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor. |
Stainless Steel Syringe | Harvard Apparatus | 702261 | Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors. |
Temperature Monitor | Omega | HH12B | Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors. |
Voltage Controller | McMaster-Carr | 6994K11 | Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor. |
Supplies | |||
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas | – | – | For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run |
Plastic Bowls or Tubs | – | – | Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used. |
Spray Bottle | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Wide-Mouth Funnel | – | – | Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter. |
Wooden Dowel | – | – | 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor |
Consumables | |||
Glass Wool | Sigma-Aldrich | CLS3950-454G | For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing |
Plastic Press-to-Close Bags | McMaster-Carr | 1959T24 | Bags for storing processed samples and for transferring to drying box |
Plastic Tote | – | – | Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying |
Plastic Weighboats or Metal Trays | – | – | Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying |