Мы представляем протокол изолировать нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги физиологических и патологических условиях. После изоляции РНК добывается из этих клеток, чтобы проанализировать их профиль выражения гена. Этот протокол позволяет для коллекции РНК высокого качества для выполнения течению анализа, как для ПЦР и transcriptomics.
Для получения детального понимания роли различных клеток ЦНС во время разработки или создания и прогрессии патологий мозга, важно изолировать эти клетки без изменения их профиль выражения гена. Данио рерио модель обеспечивает большое количество линий трансгенной рыбы, в которых обозначены конкретные ячейки типы; к примеру нейронов в NBT:DsRed линии или макрофаги/микроглии в строке mpeg1:eGFP. Кроме того, антитела были разработаны пятно конкретных ячеек, например микроглии с 4 c 4 антитела.
Здесь мы описываем изоляция нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги. Центральное место в этот протокол избегания ферментативные ткани пищеварение при 37 ° C, которые могут изменить сотовые профили. Вместо этого используется механическая система гомогенизации ткани на 4 ° С. Этот протокол предусматривает гомогенизации мозги в суспензии клеток, их иммуно окрашивание и изоляция нейронов, макрофаги и микроглии, СУИМ. После этого мы извлечение РНК из этих клеток и оценку их качества/количества. Нам удалось получить РНК высокого качества (номер целостности РНК (Рин) > 7) выполнять ПЦР на макрофагов/Микроглия и нейронов и транскриптомики анализ на микроглии. Этот подход позволяет лучше характеристику этих клеток, а также более четкое представление об их роли в развитии и патологий.
Знания о развитии мозга и заболеваний мозга значительно улучшилась в последнее десятилетие с момента первого количественная оценка мыши мозга transcriptomes1. Действительно анализ выражения генома широкий ген дает нам доступ к подробной генетической информации на ткани мозга и клетки, которые могут дополнять и совершенствовать замечания, сделанные с другими методами и средствами.
Данио рерио является мощным биологической модели, легко размножаются и изменить генетически; его оптической прозрачности на личиночных стадиях позволяет жить изображений замечания2. К сожалению, по сравнению с человека и мыши, количество доступных антител для выполнения иммуно окрашивание довольно низка. Чтобы исправить это, данио рерио трансгенных линий рыбы легко сделанное генетического изменения рыбы выразить флуоресцентных белков под ячейки типа конкретных промоутеров. Данио рерио трансгенных линий использовались в прошлом для изучения роли макрофагов и микроглии во время развития центральной нервной системы (ЦНС) и болезни3,4,5,6. Однако чтобы получить глубокое понимание этих процессов мы должны понимать изменения в экспрессии генов в типы соответствующих клеток. С этой целью мы разработали экспериментальный метод специально изолировать клетки как нейроны, макрофаги и микроглии от 3 до 8 дней после оплодотворения (dpf) личинок данио рерио мозги. Для создания протокола мы работали с линиями трансгенной рыбы, которые выражают Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в макрофагов/микроглии под Макрофаг выразил гена промоутер (mpeg1:eGFP) и DsRed в нейронах под нейронных ß тубулина промоутер (NBT:DsRed)7,8,9. Кроме того мы провели, иммуно окрашивание микроглии, используя 4 c 4, мыши моноклональные антитела, которые специально пятна данио рерио микроглии10,11. Впоследствии рибонуклеиновой кислоты (РНК) добывается из этих клеток для дальнейших количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) или транскриптом анализы. Этот протокол был разработан для эффективно гомогенизировать ткани мозга от данио рерио личинок; собирать нейронов, макрофаги/Микроглия и микроглии без изменения их целостности плазматической мембраны и наконец извлечь РНК из этих клеток в высоком качестве (RIN > 7) и количество для выполнения геномного анализа. В отличие от ранее опубликованных исследований, использующих трипсина лечения при 37 ° C переваривать мозга ткани12,13этот протокол способствует работа при температуре 4 ° C до РНК добыча шаг для уменьшения изменения профиля выражения гена. Этот шаг имеет решающее значение как Микроглия и макрофаги являются весьма чувствительных клеток, которые реагируют на изменения в их микроокружения немедленно, не изменяя их ген выражение профиль и поляризации14,15, 16.
Протокол, подробно здесь, показывает, что изоляция нейронов, макрофаги и микроглии от личинок мозги данио рерио, но практически, это может быть адаптирована к любой другой клетки в течение мозга – либо с помощью линий трансгенной рыбы или помечены специфические антитела. Этот метод позволит лучше характеристик клеток ЦНС через их анализ выражения генома широкий гена и поможет понять их роль во время разработки и заболеваний мозга.
Экспериментальный протокол, описанные здесь представляет собой надежный и эффективный метод, чтобы изолировать клетки мозга от данио рерио личинок от 3 до 8 dpf. Важно отметить, что это первый протокол, который позволяет конкретных изоляции микроглии от личинок данио рерио мозги. Протокол предназначен для сохранения целостности клеточной мембраны и свести к минимуму потенциальные изменения экспрессии генов, происходящих во время обработки. Этот последний пункт имеет решающее значение для актуальности результатов, основанных на анализе тех изолированных клеточных геномной профилей. Действительно Микроглия и макрофагов поляризации сильно зависит от их микроокружения. При 37 ° C эти клетки изменили бы их профиль выражение гена в ответ на экспериментальных условий (травмы (перерезка) ответ). Таким образом важно выполнять этот эксперимент на 4 ° C до РНК добыча, чтобы замедлить клеточные процессы и метаболических деятельности. Кроме того чтобы избежать любого воздействия на профили выражение гена вместо ферментативные ткани пищеварение при 37 ° C был выбран гомогенизации ткани мозга механические на 4 ° C.
Важно подчеркнуть, что этот метод является очень быстро; в течение дня несколько популяции клеток мозга могут быть изолированы от по крайней мере два различных экспериментальных условий и их РНК извлечены. Общая длина протокола зависит количество личинок, используемых для каждого условия как перерезка личиночной главы является ограничивающим шаг (∼ 350 руководителей/ч). В общем чтобы работать с микроглии от 3, 5 и 7 dpf рекомендуется трансектных ∼ 600 голов в тест, чтобы получить достаточно РНК для извлечения (Таблица 1). Микроглии представляют тип ячейки с самой низкой урожайности (около 112 клетки на душу на 7 dpf), количество головок может быть уменьшена для других типов клеток, включая макрофагов (около 170 клетки на душу на 7 dpf).
Еще одним преимуществом этого протокола является, что после того, как были установлены параметры в сортировщике СУИМ, же параметры могут использоваться для различных экспериментов. Было отмечено, что клеточных популяций идеально подходят от одного эксперимента на другой с воротами ранее разработанный, показаны воспроизводимость экспериментов с использованием этого метода.
Небольшой недостаток этого метода является относительно низкий объем РНК, которые собирают. Однако это ограничение является больше вопросом биологического чем технический вопрос, как количество микроглии является очень низким на ранних стадиях развития мозга (Таблица 1). Из-за этой низкой количество собранных РНК усиление шаги должны рассматриваться для выполнения анализа выражения генома широкий гена. К счастью эти шаги усиления производить достаточное количество cDNA высокого качества. Таким образом глобальные изменения в профилях выражение гена изолированных клеток могут быть изучены.
В заключение этот протокол обеспечивает надежный метод, чтобы изолировать и изучить различные типы клеток ЦНС от личинок данио рерио мозги. Это может быть применен к получить более глубокое понимание этих клеток во время разработки, а также изучить их роль в болезни.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Дэвис Клэр и доктор Вероник Мирон (королевы медицинский научно-исследовательский институт, Эдинбург, Соединенное Kingdome) для первоначального справки и обсуждения на экспериментальный подход и QMRI поток цитометрии ячейку Сортировка объекта. Эта работа была поддержана рак исследований Великобритании карьеры учреждение премии для д-р Дирк Sieger.
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Hepes | Gibco | 15630-056 | |
D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
10 mL syringe | BD | 302188 | |
Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
FACS tubes | BD | 352063 | |
Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
RNaseZap | Ambion | AM9780 |