종양 내 피 세포는 종양 microenvironment의 중요 한 결정 요인 및 질병의 과정. 여기, 인간 대 장 암 및 마약 테스트 및 병 인 연구에 사용 될 일반 콜론에서 순수 하 고 가능한 내 피 세포의 고립에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
1 차 셀 인간의 carcinomas에서 격리는 질병 개발 및 진행에 기여 하는 병원 성 메커니즘을 식별 귀중 한 도구입니다. 내 피 세포 (EC), 혈관의 안쪽 표면을 구성 직접 종양, 산소 공급, 영양 공급, 및 폐기물을 제거에 참여 하 고 그로 인하여 눈에 띄게 종양의 헌법에 관련 된 특히, microenvironment (TME)입니다. 종양 내 피 세포 (TECs) 종양 및 stromal 세포 간의 통신에 의해 설립 intratumoral microenvironment의 바이오 세포 센서로 사용할 수 있습니다. TECs 또한 치료의 대상으로 제공합니다. 따라서, 문화 이러한 세포 응답 또는 안티-신생 치료에 저항 메커니즘에 연구 수 있습니다. 최근, TECs 인간 대 장 암 (CRC)에서 전시 메모리 효과에서 파생 된 그들은 특정 TME에 따라 절연 발견 했다. 또한, 이러한 TECs 적극적으로 기여할 특정 TME의 설립에 다른 요인의 분 비에 의해. 예를 들어 prognostically 유리한 Th1 TME에 TECs 안티 신생 종양 진압 인자 분 비 단백질, 시스테인 같은 1 (SPARCL1)에서 풍부 하 고 산 성 분 비. SPARCL1 선박 항상성 조절 하 고 억제 하는 종양 세포 증식 및 마이그레이션. 따라서, 순수 하 고, 가능한 TECs 인간의 단단한 종양에서 고립의 문화 tumorigenesis에 혈관 시스템의 역할에 대 한 기능 연구를 위한 유용한 도구가 있습니다. 여기, CRC로 서 정상적인 콜론에서 기본 EC의 격리에 대 한 새로운 최신 프로토콜을 설명 합니다. 소화 기계 및 효소 조직, immunolabeling, 및 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 기반으로 하는 기술-트리플-긍정적인 세포 (CD31, VE cadherin CD105)의 정렬. 이 프로토콜을 가능한 TEC 또는 정상적인 내 피 세포 (NEC) 문화 수 FACS 정렬 대상이 62.12%의 성공률와 함께 결 조직 으로부터 분리 (41 순수 EC 문화 66 조직 샘플에서). 따라서,이 프로토콜 정상적인 결 장 및 CRC에서 인간의 EC 문화를 분리 하는 강력한 접근 방식을 제공 합니다.
종양 microenvironment (TME)와 내 피 세포 (EC), pericytes, 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 면역 세포 등 세포의 구성 된 종양 기질 종양 세포의 가까운 상호 작용으로 정의 됩니다. 이러한 세포 구획 간의 통신 기질, 또는 직접 셀 접촉 paracrine 요인 (예, 신생 성장 인자, cytokines)에 의해 구동 수 있습니다. Stromal 구획 육성 하거나 중화 종양 개시 또는 특정 TME 설립에 따라 진행.
선박 시스템으로 연결 하는 종양의 능력 진행 및 질병의 전이 핵심입니다. 선박 시스템 종양을 주로 산소와 영양소의 공급 뿐만 아니라 폐기물1,2,3의 제거에 액세스할 수 있습니다. EC, 혈관의 안쪽 표면 구성 되며 따라서이 과정에 적극적으로 참여 하는 중요 한 세포 구성 성분. 그것은 잘 알려진 종양 내 피 세포 (TEC) 그들의 해당 정상 내 피 세포 (NEC) 혈관 트리, 선박 시키는 방해 계층 등의 많은 기능에 의해 다른 또는 성숙의 감소 된 수에 의해 exemplified 감소 pericytes/벽화 EC4에 느슨하게 연결 된 셀입니다.
따라서, TECs 발암 연구에 귀중 한 셀룰러 도구입니다. TECs 주로 종양 성장과 진행3육성로 간주 됐다. 따라서, TECs 모니터링을 허용 하는 바이오 센서 및 시작, 포스터, 또는 tumorigenesis 중화 하는 병원 성 프로세스의 id로 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은5클리닉 치료 대상입니다. 따라서, 격리 TECs 및 해당 자문위도 사용할 수 있습니다 도구로 응답 또는 안티-신생 치료에 저항을의 메커니즘을 이해 하.
과거에는, 우리가 이러한 셀6,7 을 프로토콜 개발과 TECs는 뿐만 아니라 다른 자문위, 하지만 또한 그들은8에서 파생 했다 TME 다릅니다 서로 확인. 이 접근 방식을 통해 보였다 TECs 특정 TMEs에 종양 성장과 진행에 적극적으로 중화 수 있습니다 SPARCL1 같은 안티-신생 종양 진압 단백질의 분 비에 의해. 이 TECs 인간 대 장 암 (CRC)8에서 prognostically 유리한 TME의 설립에 적극적으로 기여 하는 것을 나타냅니다.
이전 연구 단단한 종양에서 인간의 TECs 격리 하려고 했습니다. 이러한 연구의 중요 한 목표를 했다, 예를 들어, 새로운 종양 내 피 세포 마커 (대금)9의 식별. TECs 레이저 서 변경 피하기 위하여 적용 된 후의 즉각적인 사용 또는 문화에 TEC 표현 형의 손실의 전략. 그러나, 후속 연구 식별이 접근10의 심각한 단점으로 벽 세포의 오염 인구. 연구소는 순수 하 고, 가능한 TECs 인간의 CRC 환자6,7에서 격리를 허용 하는 프로토콜 개발 처음 이다. 격리 된 EC 문화의 순도 보장 TECs의 여러 자기 셀 선택 (MAC) 라운드와 접근 선정 되었다. 그러나,이 방법은 비교적 긴 재배 기간 평균 (6 주), 문화 유도의 위험을 증가 하는 필요 합니다. 따라서, 다음 단계에서 목표는 수술과 수확의 첫 번째 순수 문화 사이 재배 시간을 줄이기 위해 이었다. 이 목표를 달성 하기 위해, 초기 종양의 결합 된 기계 및 효소 기반 조직 분리를 채용 하는 향상 된 프로토콜 다음 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬-개발 되었다 트리플 레이블 EC의 정렬. 이 감소 격리 시간 평균 3 주, 순수 TEC와 NEC 문화 증가 생존 기능 연구와 결과. 높은 성공률을 인간의 조직에서 실행 가능한 순수 TEC와 NEC 문화의 격리 환자가 특정 약물 개별된 치료 regimens의 개발 하는 동안 테스트에 대 한 새로운도 열 수 있습니다. 격리 접근은 다음 단락에서 상세 하다.
주로, 세 가지 다른 방법 인간의 단단한 조직, 즉 (1) immunomagnetic 농축, (2) 레이저 기정, 및 (3) FACS-정렬 EC 분수의 순수 하 고 유력한 자문위와 TECs 격리 하기 위해 지금까지 고용 되었다 있다. 대부분의 출판물에서 기계 해체에 의해 단일 세포 현 탁 액의 세대 후의 세포 immunomagnetic 농축 사용된11,,1213이었다. 예를 들어 immunomagnetic 정화의 인간의 피부 microvascular EC (HDMEC) 전자 selectin 항 체에 의해 후에 종양 괴 사 인자 (TNF)-신생아 속하고13 에서 α 치료 glioma에서 인간의 EC의 격리에 대 한 조직에 의해 보고 되었습니다 소화, percoll 그라데이션, 그리고 안티-CD31/CD105 VE cadherin 항 체12를 사용 하 여 선택 또는 인간에서 안티 CD105 항 체에 의해 유 방 암11. 프로토콜을 레이저 서 또는 FACS 정렬 고용 덜 자주 보고 되었습니다. 레이저 기정 사용 되었다, 예를 들어 잠재적인 팬-종양을 식별 하기 위해 EC에서 내 피 세포 마커 (대금)에서 파생 된 인간 대 장 암 세포의 분석 해 부9후 즉시. FACS 정렬 안티-CD31-항 체를 사용 하 여 성공적으로 시연 했다 EC 분수의 격리에 대 한 미 분화 인간 배아에서 줄기 세포14.
이러한 접근 방법은 서로 다른 장점과 단점을 고려해 야 할 수 있다. Immunomagnetic 기반 접근 방식에 대 한 장점은 정교한 장비는 필수, 선택 언제 든 지 수행할 수 있습니다 및 셀 농축은 FACS 정렬에 비해 빠른 (약 15 분) (약 1 시간). 시간이 더 긴 기간에 대 한 매트릭스의 부족 anoikis에 의해 EC의 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 따라서, FACS 버퍼에로 키 니 아 제 억제 물 Y-27632의 추가 셀 anoikis15를 방지 하기 위해 고용 되었다.
Immunomagnetic 농축의 단점은 선택의 여러 라운드는 순도 99% 이상 달성 하는 데 필요한입니다. 또한, 풍부 사이 세포 배양이 세포 복구, 문화 유물 문화 유도 지원의 나이 증가 필요 합니다. 서 레이저는 셀 수 있는 이점 사용 즉시 문화 유도 유물 감소 하지만 인접 조직 영역10에서 세포에 의해 오염 위험을 포함. 또한, 기정 하지 모든 실험실에서 설정 됩니다. FACS 정렬-기반 접근 방법의 단점 포함, 레이저 서, 장비는 정교 하 고 비용 많이 비슷합니다. 따라서,이 장비 하지 액세스할 수 있습니다 언제 든 지. 임상 설정에서 어디 관심의 조직 가용성은 정확 하 게 계획 될 수 없습니다,이 더 불리를 추가할 수 있습니다.
그러나, FACS 정렬의 주요 장점은 EC 분수 병렬로 여러 항 체에 의해 표시 될 수 있습니다. 따라서, 엄격한 제어 전략을 사용할 수 있습니다 고 순도 보장 합니다. 경험을 바탕으로, 이전 맥 기반 프로토콜 선택의 여러 라운드를 고용 했다 달리 필요 했다 아니 다시는 EC 분수의 정렬. 이 결과 향상 된 세포 생존 능력 분석의 연장된 시간 창 활성화에 FACS 접근에 3 주를 6 주 (맥 접근)에서 순도까지 크게 감소 재배 시간 이끌어 냈다. 마지막으로, FACS 정렬-기반 전략을 사용 하 여, 전반적인 절연 성공률의 개선 될 수 (12.5% 증가)를 달성. 결론적으로, FACS 정렬 기준 동시에 전략 고용 3 항 체 결합된 기계 및 효소 조직 소화에 의해 조직 다이제스트 TECs의 격리에 대 한 선택의 방법으로이 프로토콜에 설정 된 수많은 장점을 했다 그리고 인간의 대 장 암 및 콜론에서 자문위입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 기독교 Flierl, Katja Petter, 크리스티나 Schnürer (모든 사단의 분자 및 실험적인 수술), Uwe Appelt, 감사 (코어 단위 FACS 정렬) 마이클 Mroz와 우수한 기술 지원에 대 한 사이먼 Völkl (코어 단위 FACS-Immunomonitoring). 이 작품은 EN/ms 협 센터의 교부 금에 의해 임상 연구 (IZKF) 대학 의료 센터 에를랑겐, 독일 연구 재단의 지원 되었다 (DFG: 2438, s p 2에 대 한)와 루 츠 재단, 로버트 Pfleger 재단의 권한을 부여 하 여 독일 연구 재단에서 MS에 게 수 여 교부 금에 의해 뿐만 아니라 VSS [DFG: KFO257 (하위 프로젝트 4), SFB 796 (하위 프로젝트 B9)].
HBSS 1x | Gibco by Life Technologies | 14175-053 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
amphotericin B | Gibco by Life Technologies | 15290-026 | |
Scalpels, disposable | Feather | No. 23 | |
gentleMACS octo dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
human tumor dissociation kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
DMEM | Gibco by Life Technologies | 21969-035 | |
EGM-2-MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
Cell strainer, 100 µm | Falcon | 352360 | |
StemPro Accutase | Gibco by Life Technologies | A11105-01 | |
Cell counter, automated | Coulter Counter | Z1 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
CD31-FITC | BD Pharmingen | 555445 | |
CD144/VE-cadherin-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
FACS-Sorting device | Beckman Coulter | MoFlo XDP |