Méthodes de prestation orale ARN double-brin d’induire l’interférence d’ARN dans le phloème et insectes hémiptères plante-sap-alimentation

Summary

Cet article explique les nouvelles techniques mises au point pour l’administration orale de l’ARN double brin (dsRNA) à travers les tissus vasculaires des plantes pour l’interférence ARN (ARNi) en sève nourrir les insectes.

Abstract

Phloème et plantes sève alimentation insectes envahissent l’intégrité des cultures et des fruits pour récupérer des éléments nutritifs, dans le processus d’endommager les cultures vivrières. Insectes hémiptères représentent un certain nombre de ravageurs économiquement importantes des plantes qui causent des dégâts aux cultures en se nourrissant de la sève. La punaise brune marmorated (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera : Pentatomidae) et le psylle asiatique agrume (ACP), Kuwayama Diaphorina citri (Hemiptera : Liviidae) sont des insectes hémiptères introduits en Amérique du Nord, où ils sont un ravageur envahissant de spécialité de haute valeur, rangée et cultures vivrières de base et d’agrumes, ainsi qu’un ravageur de nuisance quand ils regroupent à l’intérieur. Résistance aux insecticides chez de nombreuses espèces a conduit au développement de méthodes alternatives de stratégies de lutte antiparasitaire. Double-stranded RNA (dsRNA)-médiée par l’interférence ARN (ARNi) est un gène silencieux mécanisme pour des études de génomique fonctionnelles qui a des applications potentielles comme un outil pour la gestion des ravageurs. DsRNA exogène synthétisée ou petits ARN interférents (siARN) peut déclencher silençage de génétique très efficace par le biais de la dégradation de l’ARN endogène, qui est homologue à celui présenté. Utilisation efficace et environnementale de l’ARNi comme biopesticides moléculaire pour le contrôle biologique d’insectes hémiptères exige la livraison in vivo de l’ARNdb en se nourrissant. Nous démontrons ici les méthodes pour la livraison de dsRNA aux insectes : chargement d’ARNdb en haricots verts par immersion et d’absorber de dsRNA de gène-spécifiques avec la livraison par ingestion orale. Nous avons également défini les méthodes de prestation des plantes non transgéniques à l’aide de pulvérisations foliaires, bassinage racine, injections de tronc ainsi que des granules d’argile, qui peuvent être essentielles pour la LIBERATION PROLONGEE d’ARNdb. La prestation efficace de dsRNA ingéré par voie orale a été confirmée comme un dosage efficace pour induire une diminution significative de l’expression des gènes ciblés, tels que l’hormone juvénile l’acide O-méthyltransférase (JHAMT) et de la vitellogénine (Vg). Ces méthodes novatrices représentent des stratégies pour la délivrance de dsRNA à utiliser en protection des végétaux et de surmonter les défis environnementaux pour les ravageurs.

Introduction

Insectes hémiptères comprennent certains des ravageurs plus économiquement significatifs d’agriculturebecause de leur capacité à atteindre la croissance démographique élevée et la propagation des maladies des plantes. Le BMSB, H. halys Stål, est un parasite envahissant introduite accidentellement dans l’hémisphère occidental à Allentown, en Pennsylvanie, d’Asie (Chine, Taiwan, Corée et Japon) avec la première observation en 1996¹. Depuis son introduction, BMSB a été détectée dans 43 États, avec des populations plus élevées dans le milieu de l’Atlantique (DE, MD, PA, New Jersey, Virginie et WV), ainsi qu’au Canada et en Europe et représente une menace potentielle pour l’agriculture². Comme un parasite polyphage, BMSB peut susciter des dommages à environ 300 identifiés de plantes hôtes, y compris les cultures de grande valeur tels que des pommes, raisins, plantes ornementales, cultures de semences, le soja et maïs. Dommage est causé principalement due au mode d’alimentation dite de lacérer et chasse où l’animal perce la plante hôte avec son stylet aciculaires d’avoir accès aux nutriments entre les tissus vasculaires^2,3. BMSB est aussi un parasite intérieur qu’ils peuvent trouver de résidence dans les bassins de vie tels que les écoles et les maisons en automne et hiver². Produits chimiques et des aéroallergènes sortis BMSB auraient illicite réaction allergique chez les travailleurs de récolte de fruits. BMSB peuvent aussi contribuer à la maladie allergique conduisant à une dermatite de contact, conjonctivite et rhinite chez les personnes sensibles^4,5. Un autre insecte hémiptère, l’ACP, d. citri Kuwayama (Hemiptera : Liviidae), est un ravageur important des agrumes et transmet les bactéries limitée dans le phloème (Candidatus Liberibacter asiaticus) provoquant le Huanglongbing (HLB), mieux connu comme citrus greening maladie^6,7. HLB a été pour la première fois de la Chine du Sud et s’est propagé aux 40 différents asiatique, africain, océanien, du Sud et nord-américains pays⁷. Citrus greening est un problème dans le monde entier avec la menace des pertes économiques et financières en raison de la perte d’agrumes ; par conséquent, gestion des ACP est considéré comme primordial pour prévenir et contrôler la HLB.

Mesures pour un contrôle efficace de ces insectes nuisibles requiert habituellement l’application de pesticides chimiques qui sont relativement courtes a vécu. Stratégies de lutte insecticide chimique souvent manquent de stratégies de gestion de l’environnement sécuritaire ou ont diminué la sensibilité en raison de la résistance aux pesticides dans les populations de ravageurs^8,9. Donc, le contrôle biologique des ravageurs avec biopesticides moléculaire est une alternative possible, mais son utilisation restera globalement modeste, et diverses espèces de parasitoïdes (p. ex., Trisolcus japonicus) peuvent également être efficaces comme biologiques naturels contrôles. Arni est un potentiel de nouvelles technologies pour la gestion des ravageurs envahissants avec biopesticides moléculaire¹⁰. Arni est un mécanisme de régulation génique bien décrite qui facilite le silence efficace génique post-transcriptionnel d’endogène ainsi que d’envahir les ARN doubles brins de façon séquence-spécifique, qui mène finalement à la régulation de l’expression génique à l’ARNm niveau^11,12. En bref, lorsque dsRNA exogène est internalisé dans une cellule, qu’il est transformé en siARN par un membre de la superfamille de RNase III nucléase bidentates, appelée Dicer, évolutivement conservée en vers, mouches, plantes, champignons et mammifères^{13, 14 , 15}. ces duplex siARN de 21 à 25 nucléotides est ensuite déroulé et intégré dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) comme guide RNAs. Ce complexe RISC-RNA permet l’appariement Watson-Crick base à complémentaires cibles ARNm ; Cela conduit finalement au clivage de la protéine Argonaute, une protéine de domaine multi contenant un domaine RNase H-like, qui dégrade l’ARNm correspondants et réduit la traduction des protéines, ce qui conduirait à post-transcriptionnel gene silencing^{16 , 17 , 18}.

Arni pour la lutte antiparasitaire nécessite l’instauration d’ARNdb en vivo pour réduire au silence le gène d’intérêt, activant ainsi la voie de siARN. Diverses méthodes qui ont été utilisés pour la livraison de dsRNA aux insectes et aux cellules d’insecte pour induire RNAi systémique incluent nourrir^10,19, tremper^20,21,²²de la microinjection, transporteurs comme les liposomes ²³et autres techniques²⁴. Arni a démontré chez Caenorhabditis elegans pour faire taire l’expression des gènes unc-22 par le feu et Mello²⁵, suivi par précipitation dans l’expression des gènes crépus chez Drosophila melanogaster,²⁶. Les premières études fonctionnelles utilisées microinjection pour livrer des dsRNA chez les insectes, tels que Apis mellifera^22,27, Acyrthosiphon pisum,²⁸,²⁹de Blattella germanica, Halys H.³⁰et lépidoptères (évaluées par Terenius et al. ³¹). microinjection est avantageuse pour livrer une dose précise et exacte sur le site d’intérêt chez l’insecte. Quoique ces piqûres septiques peuvent déclencher l’expression de gènes liés immunitaires due à un traumatisme³², par conséquent, écartant de sa pratique dans le développement agricole de biopesticides.

Une autre méthode de prestation des ARNdb en vivo est par trempage, qui implique ingestion ou absorption de dsRNA par suspension des animaux ou des cellules généralement dans le milieu extracellulaire contenant des ARNdb. Trempage a été utilisé pour induire efficacement Arni dans les cellules de culture de tissus Drosophila S2 pour inhiber en aval-de-Raf1 (DSOR1) mitogène-protéine kinase kinases (MAPKK)²⁰, ainsi que chez c. elegans pour réduire au silence les POS-1 gène³³. Cependant, dsRNA envoyée à l’aide de trempage est moins efficace pour induire l’ARNi contre microinjection²⁰. Arni médiée silencieux chez un insecte à chiquer fut montrée à la chrysomèle des racines du maïs (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) en perfusant l’ARNdb dans une gélose artificiel alimentation¹⁰. De précédentes études ont résumé des méthodes permettant de livrer des ARNdb infusé dans les régimes naturels spécifiques aux arthropodes³⁴. Ces méthodes de livraison ont été déterminées plus efficace comparativement à des moyens artificiels de livraison ; comme dans le cas de la mouche tsé-tsé (Glossina morsitans morsitans), où égale précipitation d’un gène du système immunitaire a été observée quand les ARNdb a été livré par la farine de sang ou micro-injection³⁵. De même, la livraison de dsRNA par les gouttelettes dans apple brun léger moth (Epiphyas postvittana)³⁶, larves de teigne des crucifères (Plutella xylostella)³⁷, ainsi que miel abeilles^38,39 induite par ARNi efficace. Des expériences d’Arni plus efficaces dans hémiptère ont utilisé des injection d’ARNdb⁴⁰ parce que l’administration orale d’ARNdb en insectes hémiptères est ardue car il doit être livré à travers les tissus vasculaires de la plante hôte. RNAi efficace s’observe également dans les pays ACP et vitreux ailes sharpshooter cicadelle (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA a été livré à travers agrumes et de vignes qui avaient absorbé des ARNdb dans les tissus vasculaires par bassinage racine, foliaire vaporisateurs, des injections de tronc ou absorption par boutures^{41,42,43,44,45,46}. Cela a également entraîné le premier brevet pour dsRNA contre les pays ACP (2016, nous 20170211082 A1). Livraison des siARN et dsRNA à l’aide de supports tels que des nanoparticules et liposomes confère une stabilité et augmentation inhabituelle de l’ARNdb livré émergent rapidement^{23,47,48,49 ,},⁵⁰. Une nouvelle classe de vecteurs à base de nanoparticules d’acides nucléiques pour in vitro et in vivo qui ont été résumées spécifiquement pour des applications thérapeutiques peuvent transmettre un potentiel immense comme vecteurs de livraison adapté⁵¹. Nanoparticules comme un véhicule de livraison pour l’ARNdb peuvent avoir des inconvénients dont la solubilité, hydrophobie ou bioaccumulation limitée⁵², mais une livraison aider ã polymère adapté peut compenser ces inconvénients. Développement et l’utilisation de la prestation des nucléotides émergent aussi appelés « antisens », qui sont simple brin ARN/ADN duplex⁴⁶.

La vitellogenèse chez les arthropodes est une clé processus contrôlant la reproduction et régulée par l’hormone juvénile (JH) ou l’ecdysone, qui sont les inducteurs principaux de synthèse de la Vg de la masse grasse ; le Vg est finalement repris par l’ovocyte en développement par l’intermédiaire de l’endocytose médiée par le récepteur Vg⁵³. VG est un groupe de polypeptides synthétisés extraovarially, qui est essentiel pour le développement de la protéine grands oeufs jaune vitellin^54,55, et par conséquent, il est important dans la reproduction et vieillissement⁵⁶. VG a été réduit au silence avec succès dans les nématodes⁵⁷ ainsi que dans l’abeille à miel (Apis mellifera) où par l’appauvrissement de la couche de Vg ARN a été observée chez les adultes et œufs²². Arni silençage de médiation génique post-transcriptionnel de Vg a été testé car on pensait que son appauvrissement conduirait à un effet phénotypique observable telles que réduit la fertilité et la fécondité, pour éventuellement aider à contrôle BMSB. Le gène JHAMT qui code pour la S-adénosyl-L-méthionine (SAM)-dépendante JH acide O-méthyltransférase, catalyse l’étape finale de la JH biosynthèse voie⁵⁸. Dans cette voie farnésyl pyrophosphate (FPP) est séquentiellement transformé farnésol, acide farnesoic, suivie de la conversion de méthyle farnesoate JH par JHAMT. Cette voie est conservée chez les insectes et arthropodes spécifiquement pour la métamorphose, un processus développemental réglementé par hormones^59,60,,⁶¹. Chez b. mori, expression des gènes JHAMT et l’activité biosynthétique JH dans les corps allates suggèrent que la répression transcriptionnelle du gène JHAMT est cruciale pour la terminaison de JH biosynthèse⁵⁸. Par conséquent, les gènes JHAMT et Vg ont été sélectionnés pour épuisement ciblée utilisant l’ARNi. Arni a également été testé dans les arbres d’agrumes pour le contrôle de l’ACP et GWSS. Arbres d’agrumes ont été traités avec dsRNA par bassinage racine, la tige de robinet (injections de tronc), ainsi que les pulvérisations foliaires avec ARN doubles brins contre insectes spécifiques arginine kinase (AK) transcriptions^42,44. L’application topique de dsRNA a été détectée dans la canopée des arbres d’agrumes, ce qui indique une livraison efficace à travers les tissus de plantes vasculaires et a entraîné une mortalité accrue dans les pays ACP et GWSS^{41,42, 45}.

Dans la présente étude, nous avons identifié une méthode de livraison d’alimentation naturelle pour les traitements tels que l’ARNdb. Cette nouvelle technique a ensuite été utilisée pour faire taire le JHAMT et le Vg mRNA à l’aide de gènes spécifiques ARN doubles brins en nymphes BMSB comme démontré plus tôt⁶². Ces nouveaux protocoles de livraison démontrés ici remplacent des systèmes de livraison RNA conventionnels qui utilisent des sprays topiques ou des microinjections. Légumes et fruits, tige robinet, sol Drenchage et absorbants d’argile en peuvent servir pour la livraison de dsRNA, ce qui est essentiel à la poursuite du développement de la gestion des ravageurs et pathogènes des biopesticides.

Protocol

1. BMSB élevage Arrière BMSB insectes selon les directives de pratique de laboratoire standard et décrites précédemment63. Élever des insectes ACP (d. citri) sur Citrus macrophylla dans une serre (22 ° C) et de la lumière naturelle. Utiliser l’ACP adulte, environ 5-7 jours après l’éclosion. 2. sélection des régions des gènes et la synthèse In Vitro d’ARNdb Sélectionner des gènes spécif…

Representative Results

Livraison de légumes dsRNA de médiation en se nourrissant de larves de stade BMSB 4ème a été testé pour le développement des biopesticides moléculaires à l’aide de RNAi de ravageurs envahissants. BMSBs flux à l’aide de leurs stylets aciculaires par un mécanisme appelé lacerate, puis rincez, qui provoque des dégâts considérables aux cultures. Mince de haricots verts biologiques, P. vulgaris L., ont servi à vérifier si les éléments nutritifs ou dsR…

Discussion

Arni s’est avéré pour être un outil important pour explorer la fonction biologique du gène et la réglementation, avec un grand potentiel d’être utilisé pour la gestion des ravageurs^{19,68,69,70, 71}. la conception et la sélection d’un ou plusieurs gènes appropriés pour faire taire dans une espèce donnée d’insectes et la méthode de livraison…

Materials

BMSB (H. halys) insects	USDA
ACP (D. citri) insects	USDA
organic green beans	N/A
Citrus plants	USDA
sodium hypochlorite solution	J.T. Baker
green food coloring	McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers	Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture)	Sigma
Primers	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	Applied Biosystems
Spray bottle	N/A
Parafilm	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen